半胱氨酸蛋白酶与消化系肿瘤化疗

1、半胱氨酸蛋白酶与消化系肿瘤化疗作者：冯斌时间：2007-11-23 10:15:00 摘要 半胱氨酸蛋白酶（Caspases）激活级联反应在凋亡调控中占核心作用，它涉及2条主要途径：死亡介导途径和线粒体依赖途径。不同的凋亡刺激信号经各自特定途径的起始不同的Caspases级联反应，进而激活下游的效应Caspases，诱发细胞凋亡。研究发现有些细胞毒化疗药物通过半胱氨酸蛋白酶而诱导消化系肿瘤细胞凋亡。目前，通过调节Caspases的活性促使癌细胞凋亡是肿瘤治疗研究中一个值得探索的领域。 关键词 半胱氨酸蛋白酶；细胞凋亡；消化系肿瘤；化疗 近年来，随着研究的深入，在哺乳动物体内发现了多种半胱氨酶蛋

2、白酶。这些结构特点相似的酶构成了一个蛋白酶家族，称之为Caspases家族。它是执行细胞凋亡的主要酶类。这些蛋白酶在细胞凋亡中的作用及机制和在肿瘤的发生、发展及化疗中的意义，是肿瘤学基础及临床研究领域的热点之一。本文就Caspases与细胞凋亡、凋亡调控基因、消化系肿瘤及化疗的关系作一简要综述如下。 1 Caspases家族概述 1993年Yuan等发现秀丽隐杆线虫的Ced-3基因与哺乳动物细胞ICE（interleakin-1 converting enzyme）存在功能和序列上的高度同源，与ced-3一样ICE高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡。目前在哺乳动物细胞中已发现有14种ICE/c

3、ed-3蛋白酶家族成员1，命名为半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶（Cysteinyl aspartate specific protease），简称Caspases，有学者称之为“半胱天冬酶”。它们具有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性。许多Caspases在哺乳动物的细胞凋亡中发挥重要的作用。细胞凋亡是从内外多因子复杂的相互作用诱导产生凋亡信号，传递至Caspases，并使其活化为开始，以蛋白底物裂解、细胞解体为结局，从而使细胞凋亡得以完成。因此，对于Caspases的深入研究将对其依赖的细胞凋亡相关肿瘤和疾病有可能提供治疗的又一新靶点，从而为基因治疗提供新的途径。 1.1 Caspases的生物

4、学特性 Caspases最初表达为蛋白酶的形式，基本结构包括：N端结构域参与酶功能激活调节及大、小亚基提供与底物结构及催化所需的氨基酸。Caspases可专一、高效地特异性水解一系列的蛋白底物，并导致蛋白质功能 丧失或改变2。Caspases按功能分为启动子Caspases即Caspases-2、Caspases-8、Caspases-9、Caspases-10和效应子Caspases，即Caspases-3、Caspases-6、Caspases-7。效应子被启动激活，执行最终的凋亡效应，Caspases-3（CPP32）是最重要的细胞凋亡执行者之一3。而启动子Caspases则被特定的结合

5、蛋白、其他Caspases及本身激活4。这些结合蛋白质将凋亡信号和Caspases联系起来，决定2种基本凋亡途径：线粒体途径和死亡受体途径。最近报道的第3条途径是小鼠体内的Caspases-12介导内质因特异性凋亡5。 1.2 Caspases与调控基因 p53基因 p53基因作为一种转录因子能促进或抑制很多与细胞周期及凋亡相关基因的表达（如p21和Bax等）。因此，p53可通过直接或间接调节凋亡通路中多个关键因子而调控凋亡。Burns6的研究发现人肿瘤细胞过表达p53能诱导该细胞凋亡，而特异性抑制剂分别抑制了Caspases-8及Caspases-9后均能抑制这种p53依赖的凋亡。Fuchs

6、等发现放射损伤引起的小鼠胸腺细胞凋亡时，p53依赖于Caspases-3的活化。但p53亦能抑制昆虫、线虫、哺乳动物细胞的凋亡，p53阻断细胞凋亡机制在于与Caspases家族成员（包括Caspases-1、Caspases-2、Caspases-3、Caspases-4）形成p53-Caspases复合体，从而抑制Caspases催化活性。 Bcl-2家族 Bcl-2家族迄今为止发现的Bcl-2家族同源蛋白不少于15种，均含有1种以上Bcl-2家族共同源序列（BH1-BH4）。按结构功能不同分为前凋亡蛋白（preapoptotic protein）和抗凋亡蛋白（antiapoptotic p

7、rotein）。Bcl-2或其他抗凋亡蛋白过表达使许多本可致PT孔（permeability transition pore，PTP）开放，细胞色素C及凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）释放的刺激失效，Caspases活化降低，从而抑制凋亡；而前凋亡蛋白（又称凋亡蛋白）Bax过表达导致线粒体跨膜电位缺失及细胞色素C释放，导致Caspases活化增强，促进凋亡。另外，Bcl-2C末端产物能触发细胞凋亡，裂解产物进一步激活下游的Caspases，并导致Caspases级联反应放大。 Cmyc基因 Cmyc基因是调控细胞增殖的重要基因，其表达产物Cmyc蛋白是

8、一种转录因子。在Cmyc介导的细胞凋亡过程中，可见Caspases-3进入活化状态，当其选择性抑制时，能部分抑制Cmyc诱导的细胞凋亡，说明Caspases蛋白酶家族，尤其是Caspases-3参与了Cmyc介导的细胞凋亡途径7。 此外，还有一系列蛋白称为凋亡抑制因子（inhibitors of apoptosis，IAP），具有直接阻止凋亡作用，IAP与Caspases蛋白酶结合可使后者失活。虽然其抑制目标还不清楚，但在体外实验中可抑制Caspases-3和Caspases-7；CrmA亦能抑制某些启动性Caspases，抑制细胞凋亡发生；TGF能阻止神经鞘氨醇诱导的HL-60细胞中Casp

9、ases-3活化，抑制细胞凋亡。以上说明各不同调控基因与Caspases关系密切，且影响Caspases蛋白酶的活化，进而促进或抑制细胞凋亡。 2 Caspases与细胞凋亡 1972年Kerr等8根据细胞形态学特点，首次提出细胞凋亡（apoptosis）这一概念。细胞凋亡又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PDC），是一种基因控制的细胞自主性死亡过程。它是多细胞生物体内的一个重要生命征象，既出现在个体发育过程中，也出现在正常生理状态或疾病中；既在体内发生，也出现在体外培养物中。细胞凋亡的形态学和生物化学改变。 2.1 形态学改变 细胞凋亡涉及单个细胞成为非同步发生

10、的一小部分细胞。先为单个细胞与周围细胞分离，细胞皱缩、胞质凝缩、细胞器聚集、核染色逐渐浓集。以后胞核固缩、碎裂，细胞下陷包裹碎片和细胞器，形成包膜完整的凋亡小体（apoptotic bodies）。凋亡小体很快被邻近的细胞吞噬降解。 2.2 生物化学改变 （1）钙离子和蛋白激酶改变：细胞内Ca2+的堆积和重新分布，细胞核内Ca2+增多，激活核酸内切酶的活性；（2）核酸内切酶激活把DNA降低成180200碱基对倍数的核苷酸片段，呈梯状电泳现象；（3）组织谷氨酰胺转移酶的积累并激活；（4）细胞骨架如肌动蛋白的变化；（5）细胞表面糖链、植物血凝素与玻连蛋白的受体增加，磷酯酰氨酸的外露可改变细胞表面的

11、生化特性。随着对细胞凋亡的研究深入，目前学者们认为Caspases是细胞凋亡机制中重要的效应因子之一，现已发现14种Caspases家族成员，其中至少2/3的Caspases与细胞凋亡相关并参与多种与凋亡有关的机体生理性或病理性过程。 3 Caspases与消化系肿瘤 以往对肿瘤的研究，多认为肿瘤细胞无限增殖是肿瘤形成的关键。近年来，随着对细胞凋亡研究的深入，人们越来越重视细胞凋亡与肿瘤的关键，认识到组织的内环境稳定实际上是细胞增殖和死亡之间的平衡。现认为在肿瘤发生、发展的各个阶段均存在细胞凋亡，与Caspases家族有着密切关系。消化系肿瘤亦是如此。Hoshi等9研究33例人胃癌组织发现，Caspases-3的表达较正常组织明显降低，提示Caspases介导细胞凋亡的异常降低可能与胃癌的发生密切相关；国内林万隆等10对50例胃癌组织中Caspases-3和bclx2表