禽大肠杆菌病疫苗研究进展.docx

1、中国畜牧兽医2015,42(1):0234-0244ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicinedoi：10.16431/ki.1671-7236.2015.01.037禽大肠杆菌病疫苗研究进展马兴树(河北工程大学农学院分子生物学实验室，邯郸056021)摘要：致病性大肠杆菌(APEC)是引起家禽多种肠外疾病如气囊炎、心包炎、肝周炎、蜂窝织炎及败血症的主要人畜共患病原菌。在过去的数十年间，试验了多种不同类型的疫苗用于本病的控制。鉴于APEC血清型较多且不同血清型之间缺乏交叉免疫保护，故生产上使用的APEC疫苗研究进展缓慢.作者对不同类型APEC疫苗进行了综述并

2、提出未来的研究方向。关键词：禽大肠杆菌病；灭活疫苗；弱毒疫苗；亚单位疫苗；广谱疫苗；未来疫苗中图分类号:S858.3文献标志码：A文章编号：1671-7236(2015)01-0234-11ResearchProgressonVaccinesofAvianColibacillosisMAXing-shu(LaboratoryofMolecularBiology,CollegeofAgriculfure,HebeiUniversityofEngineering,Handan056021,China)Abstract:AvianpathogenicEscherichiacoli(APEC)ison

3、eofthemostimportantzoonoticpathogensofanumberofextra-intestinaldiseasesinthepoultryindustry.includingairsacculitis,pericarditis,perihepatitiscellulitisandsepticemia.Varioustypesofvaccinehavebeentestedoverthepastfewdecadesforcontrolofaviancolibacillosis.Unfortunately,vaccinesusedinpoultryproductionma

4、ketheslowprogressoftheresearchestodate,asAPECsareserotypicallydiversewithvaccinesfailingtocross-protectionagainstheterologouschallenge.HereinwereviewthedifferentcategoriesofAPECvaccinesthathavebeentestedandprovideaninsightintothefutureofAPECvaccines.Keywords:aviancolibacillosis；inactivatedvaccine；at

5、tenuatedvaccine；subunitvaccine；broadspectrumvaccine；futurevaccine收稿日期：2014-09-16基金项目：河北省教育厅科技支撑计划项目(13226602D)作者简介：马兴树(1963-),男.河北张家口人，博士，教授，主要从事动物传染病防治及病原微生物分子生物学的教学与研究工作通信作者：马兴树E-mail：maxinjzshu肉大肠杆菌病(aviancolibacillosis,AC)是由禽致病性大肠杆菌(avianpathogenicEscherichiaco-仃，APEC)引起鸡、火鸡及其他禽类急性、全身性肠外感染的总称，临床

6、上以心包炎、肝周炎、气囊炎、蜂窝织炎、败血症及输卵管炎、腹膜炎、雏鸡脐炎和肿头综合征等较为常见，是目前导致世界养禽业特别是肉鸡业经济损失最为严重的细函性传染病。感染APEC的禽群死亡率增高、胴体废弃率增加、生长率及饲料转化率下降，有研究结果表明.APEC与其他肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)如新生儿脑膜炎大肠杆曲(NMEC)及尿道致病性大肠杆留(UPEC)具有相似的毒力基因及致病能力，是重要的食源性人畜共患病原菌此外，APEC亦是通过其携带质粒和遗传物质交换而传播耐药基因的主要来源。多年的生产实践表明，通过消除易感因素或通过药物防控禽大肠杆菌病效果甚微，且随着耐药菌株不断产生及药物残留问题的增

7、加，禽产品质瓯安全愈来愈受到人们的重视。因此，利用非抗生素方法防控APEC将是未来发展的必然趋势，其中接种疫苗是有效防控禽大肠杆菌病发生和流行、减少禽产品immunizaionJ.AviDis1985,29：1108-1117.18HellerED.LeitnerH,DrabkinNctal.PassiveimmunisationofchicksagainstEscherichiacoliCJ.AvianPathol,199049：345-354.19：Dho-MoulinM,FairbrotherJM.AvianpathogenicEscherichiacoli(APEC)J.VetRes1

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9、andImmunity2005.73(8):4810-4817.22 GhunaimHAbuMadiMA,KariyawasamS.AdvancesinvaccinationagainstavianpathogenicEscherichiacolirespiratorydisease：PotentialsandlimitationsJ.VeterinaryMicrobiology.172:13-22.23 FrommerA,FrcidlinP,HellerED,etal.Adherence-associatedcharacteristicsandpathogenicityofEscherich

10、iacolifromaviancolibacillosislJ.AvianPathol,1990,19：547-554.24 FrommerAFreidlinPJtBockRR*etaLExperimentalvaccinationofyoungchickenswithalive,non-pathogenicstrainofEscherichiaAvianPathol,1994,23:425-433.25 NivasSCPomeroyBS.AttenuationofpathogenicEscherichiacoliusingacridineorangeA.In：AbstractsofConfe

11、renceofResearchWorkersonAnimalDiseasesCj.Chicago,1985.26 NavehMWRonE乙Vaccinationagainstcolisepti-cemiainchickensA.35thWesternPoultryDiseaseConferenceC.1985.27 罗贤忠，黄青云，林泰松.禽大肠杆菌血清型02.078融合双价弱毒菌株免疫原性的研究口.华南农业大学学报,1998,19(2):50-54.28黄育云，罗金顶，任涛，等.禽大肠杆萌耐药标记弱毒菌株02(Norr,Chi)和078(Chlr,Nor*)的培育J.华南农业大学学报.199

12、7,18(2):89-93.29 陈红英，黄片云，陈根植.愈大肠杆菌O2.078及其耐药融合菌株的外膜蛋白免疫研究J.华南农业大学学报,2005,26(1):106-109.30 KwagaJK,AllanBJ,vanderHurkJV,etal.Acar-ABmutantofavianpathogenicEscherichiacolisero-group02isattenuatedandeffectiveasaliveoralvaccineagainstcolibacillosisinturkeysJ.InfectionandImmunity,1994,62：3766-3772.31Pcig

13、hambariSM,HunterDB,ShewenPE*ctal.Safety,immunogenicity,andefficacyoftwoEscherichiacolicyaerpmutantsasvaccinesforbroilersD.AviDn,2002,46:287-297.32KariyawasamS.WilkieBN,GylesCL.Construction,characterizationandevaluationofthevaccinepotentialofthreegeneticallydefinedmutantsofavianpathogenicEscherichiac

14、oliJ.AviDis.2004.48：287-299.33_SalehiTZ,TabatabaeiS,KarimiV,etaLAssessmentofimmunityagainstaviancolibacillosisinducedbyanaroAmutantcontainingincreasedserumsurvivalgeneinbroilcrsLJj.BrazJMicrobiol.2012,43：363-370.34FilhoTF.FavaroCIngbermanM,ctal.EffectofsprayEscherichiacolivaccineontheimmunityofpoult

15、ry.AviDis,2013,57:671-676.35NaganoT,KitaharaR,NagaiS.AnattenuatedmutantofavianpathogenicEscherichiacoliserovar()78：ApossiblelivevaccinestrainforpreventionofaviancolibacillosisJ.MicrobiolImmunol,2012,56：605612.,36：LangermannS.PalaszynskiS.BarnhartM,etal.PreventionofmucosalEscherichiacoliinfectionbyFi

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17、-689.39vandenBoschJF.VaccineagainstE.colisepticaemiainpoultryLP.USPTO,USA.1993.40KariyawasamS.WilkieBN,GylesCL.ResistanceofbroilerchickenstoEscherichiacolirespiratorytractinfectioninducedbypassivelytransferredeggyolkantibodiesJ.VetMicrot)iol2004,98:273-284.41jVandemaeleF,BleyenN,AbuaboudOetal.Immuni

18、zationwiththebiologicallyactivelectindomainofPapGUinducesstrongadhesion-inhibitingantibodyresponsesbutnotprotectionagainstavianpathogenicEscherichiaAvianPathol*200635:238-249.42ChartH,GriffithsE.AntigenicandmolecularhomologyoftheferricenterobactinreceptorproteinofEscherichiacoliJJ.JGenMicrobiol1985.

19、131:15031509.43BolinCA,JensenAE.Passiveimmunizationwithantibodiesagainstiron-regulatedoutermembraneproteinsprotectsturkeysfromEscherichiacoltsepticeniiaJJ.InfectionandImmunity,1987,55:1239-1242.：44LeRoyD.CrouzierC.DhoMoulinM.ctal.Resultsofpassiveandactiveimmunizationdirectedagainstferricaerobactinin

20、experimentalenterobacterialinfectionsinmiceandchickensJJ.ResMicrobiol1995,146:167-174.45EmeryI)AStraubDE*HuisingaR,eial.ActiveimmunizationusingasiderophorereceptorproteinPj.PublicationU.S.P.USA.2000.46KariyawasamS,WilkieBN.HunterDB.etal.Systemicandmucosalantibodyresponsesioselectedcellsurfaceantigen

21、sofavianpathogenicEscherichiacoliinexperimentallyinfectedchickensJAviDis.2002,46：668678.47jHorneSM.Pfaff-McDonoughSJ.GiddingsCW,etal.Cloningandsequencingofthei$sgenefromavirulentavianEscherichiacoliJ.AviDis.2000,44:179-184.48PfaffMcDonoughSJHorneSM.Giddings(W.etai.(omplementresistancerelatedtraitsam

22、ongEsch-erichiucoliisolatesfromapparentlyhealthybirdsandbirdswithcolibacillosisJ.AviDis2000.44：23-33.!49R(driguez-SiekKE,GiddingsCW.DoctkottC,etal.CharacterizingtheAPECpathotypeJJ.VetRes.2005,36:241-256.50 LynneAM.FoleySLNolan.K.ImmuneresponsetorecombinantEacherichiacoliIssproteininpouhryJ】.AviDis.2

23、00650:273-276.51 LynneAM,KariyawasamSWanncmuehlerYetal.RecombinantIssasapotentialvaccineforaviancoli-bacillois.AviDis.2012.56；192-199.52：ProvenceI)L.CurtissR3rd.Isolationandcharacterizationofageneinvolvedinhemagglutinationbyana-vianpathogenicEscherichiacoliJ.InfactionandImmunity,1994.62：1369-1380.53

24、 KostakiotiM,StathopoulosC.FunctionalanalysisoftheTshautotransporterfromanavianpathogenicEscherichiacolistrainJ.InfeetionandImmunity.2004,72:5548-5554.54 DelicatoER.deBritoBG*KonopatzkiAP.etal.Occurrenceofthetemperature-sensitivehemagglutininamongavianEscherichiacoliJ|.AviDis.2002.46：713-716.55OttoB

25、RtSijbrandiRLuirinkJ.etal.(rystalstructureofhemoglobinprotease.ahemebindingaulotranporterproteinfrompathogenicEscherichiacoliJ.JHiologicalChemistry.2003,2H0：17339-17345.56KobayashiRKT.GaziriLCJ.VidottoM(.EunctionalactivitiesoftheTshproteinfromavianpathogenicEscherichiacoli(AI*EC)JVetSd.2010.11(4):3)

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27、inalpathogenicEscherichiaPNAS.2010.107,90729077.59RolandK,CurtissR3rd,SizemoreIXConscructionandevaluaiionofhdeltacyadeltaerpSabnonellulyf)hirnuriumstrainexpressingavianpathogenicEsiherichiacoli()78LPSasavaccinetopreventairsacvulitisinchicken乩J.AviDis*1999.43:429-441.-60MillerT.FantonM.NickelsonS.cia

28、l.SafetyandmunogenicityofbacterialandtobaccoplantcelllinederivedrecombinantnativeandnwtatHExhtriihiucoliheatlabiletoxininchickensJ.AvianPathol.2012,45s441-449._61BaoYZhaiZ.WangS.etal.Chapcronin(iroEL：AnovelphylogeneticallyconservedproteinwithimmunoreactivityofavianpathogenicEscheriJiiuuhisolatesfrom

29、duckidentifiwibyimniunoprott-omicsLJ.Vaccine,2013,31,2947-2953.62 ChaudhariAA*LeeJH.EvaluationoftheadjuvanteffectofSalmonellabasedEscherichiacoliheatlabiletoxinBsubuailsontheefficacyofaliveSahtuinelladeliveredavian|aihogcnicEscherichiacolivaccineLJj.AvianPaMoZ.2013.42:365-372.63 RonRZ.Hostspecificit

30、yofsepticemicEinionsinMicrobiology.2006.9:28-32.64.DzivaF.StevensMP.Colibaciilosisinpoultry：InravellingthemolecularbasisofvirulenceofavianpathogenicEscherichiacoliintheirnatural.AvianPathology.2008.37(4)：355-366.(责任编辑就晓云)污染及保证食品安全的重要途径。目前根据疫苗的抗原组分及制苗方法，预防禽大肠杆菌病的疫苗可分为灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗、广谱疫苗及未来疫苗5类。作者将对这

31、5类疫苗进行简要阐述，以期为禽大肠杆菌病的防控提供参考。1灭活疫苗1.1理化方法灭活疫苗大肠杆菌灭活疫苗可通过福尔马林、乙醇、丙酮、加热、超声波裂解及辐射等理化方法灭活制备。1957年，Gross率先使用福尔马林灭活APEC02:K1和078:K80免疫接种肉仔鸡，然后用02或078菌株进行攻毒以评估疫苗对同源和异源菌株的保护效力。结果发现078对同源萌株（078）比对异源菌株（。2）攻毒有更好的保护力，而用（）2疫苗免疫的仔鸡对2种血清型攻毒菌株无保护力。随后，Deb等分别通过乙薛、丙酮、福尔马林、加热灭活及福尔马林灭活/明矶沉淀方法对（）78:K80大肠杆菌制备疫苗，经皮下、肌肉和腹腔内接

32、种3周龄肉仔鸡，结果发现福尔马林灭活/明矶沉淀疫苗组可抵抗同源菌株肌肉攻毒至6周龄。同样，与078:K80疫苗相比，用APEC153株02:K1制备的疫苗免疫仔鸡，尽管能诱导产生高滴度的0和K凝集素，但对同源菌株攻毒缺乏保护。因此，只通过对O和K抗原的抗体应答并不能确定APEC疫苗的效力，因为在相同的抗原（02:K1）中加入弗氏完全或不完全佐剂后皮下接种23周龄的仔鸡则可获得保护。相关的研究也证实福尔马林灭活的O1:K1油佐剂疫苗经皮下接种4和6周龄或5和7周龄鸡，2周后用3X106CFU的APEC气囊攻毒，结果只对同源菌株保护59七鉴于此，Schwartz等眄制备了多价（01、02和078）

33、油乳剂疫苗分别于1和14日龄2次肌肉接种仔鸡后，对3种血清型菌株攻毒均可产生明显的保护，但对异源APEC麻株攻毒无效，故APEC疫苗缺乏通用性。虽然灭活疫苗只对同源菌株提供保护，但攻毒途径及灭活方法亦会影响试验结果。如用加热或福尔马林灭活的078:K80:H9肌肉免疫1和2周龄的火鸡，10d后用同源菌株静脉攻毒，结果全部免疫火鸡均出现APEC感染病变回。Melamed等】通过超声灭活02：K1和078:K80大肠杆菌并加入氢氧化铝佐剂制备疫苗，皮下接种10日龄雏鸡，10d后用同源和异源菌株皮下攻毒，通过死亡鸡数和出现APEC病变鸡数确定保护效果，结果表明02:K1疫苗对同源（02：K1）和异源

34、（078-K80）菌株攻毒提供保护，而078:K80疫苗对异源（。2:K1）菌株攻毒无保护。经超声灭活的疫苗，其保护效果也优于加热、福尔马林或辐射处理灭活的疫苗，其保护程度与攻毒时ELISA检测的抗体滴度呈正相关。进一步将超声灭活的（）2:K1制备膜泡（membranevesicles）疫苗免疫火鸡，则可获得对同源菌株攻毒保护。此种疫苗不仅产生ELISA抗体，同时也刺激补体系统和细胞毒性T细胞的杀的活性。大肠杆菌J5是一株遗传稳定、粗糙型突变株，缺乏尿苜二磷酸半乳糖4差向异构酶（UDP-半乳糖-4-差向异构酶，催化菌体侧链连接核心抗原的酶），对雏鸡及鸡胚无致病性5侦。将其80P水浴加热灭活1h

35、（6X108CFU/mL）,分别静脉接种5、14和20日龄肉仔鸡各0.25.0.5和1mL,28日龄静脉攻毒078菌株（6X108CFU/mL）后连续观察7d。结果表明接种灭活J5的仔鸿全部健活，剖检亦无肉眼可见病变，其所产生的血清抗体与078具有交又反应，这可能与J5细胞壁侧链不完整而使核心抗原簇暴露有关。事实上，所有血清型大肠杆菌的核心抗原在化学结构及免疫学上都相似，这为开发广谱大肠杆菌灭活疫苗指明了方向由于APEC灭活疫苗通常需要注射接种，同时鉴于母源抗体可传递给子代，故免疫种鸡即可使仔鸡获得被动保护，克服了规模化鸡场单个注射接种仔鸡的弊端。1985年,Rosenberger等:首次用福

36、尔马林灭活的02.078和035APEC制备油乳剂疫苗于20周龄1次或20和25周龄2次免疫种母鸡，微量凝集试验检测表明被免种鸡的特异抗体升高。对被免和未免种鸡孵出的仔鸡气管攻毒同源菌株表明母源抗体可保护仔鸡减少出壳后死亡率和损伤长达2周。Chaffer等亦观察到火鸡抗APEC的母源抗体出壳时滴度高，其后逐渐下降至14日龄低滴度。种鸡亦获得了类似结果，即出壳后仔鸡至21日龄时检测不到APEC抗体口3：。尽管如此，但出壳21d后的仔鸡/火鸡必须获得保护，因为此日龄段是易感APEC的高峰期购。1.2生物方法灭活疫苗（菌蜕疫苗）菌蜕（bacterialghosts,BGs）作为新型基因灭活苗，具有与

37、活菌形态结构一致，但无活菌的致病作用并可诱导机体产生体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫。据Jalava等（2。）介绍用制备的大肠杆菌078：K80菌蜕经口服、肌肉注射和滴鼻免疫1日龄维鸡，免疫后21d用同源菌株攻毒。尽管全部免疫接种鸡发病，但肌肉和口服免疫组的死亡率明显降低，自心脏和肝脏回收攻毒菌株也明显减少，而滴鼻免疫组的死亡率与对照组相同。因此，1日龄雏鸡口服大肠杆078:K80菌蜕疫苗优势明显。Mayr等2。用不添加任何佐剂的肠出血性大肠杆菌（0157:H7）菌蜕疫苗单次口服免疫小鼠，可诱导产生细胞与体液免疫。免疫小鼠后第55天用异源肠出血性大肠杆萌进行致死性攻毒，其免疫保护率为86%；如于2

38、8d进行第2次加强免疫，则小鼠的免疫保护率可高达93.3%,而对照组存活的小鼠分别为26.7%和30.0%。因此,利用单剂量大肠杆菌菌蜕疫苗免疫的动物可获得良好的免疫保护，其交叉免疫保护效果也优于其他疫苗。综上所述，灭活疫苗的效力不仅与制苗用APEC菌株血清型、佐剂类型、制苗方法及接种途径和次数有关，同时还受免疫鸡日龄的影响。目前研发的APEC灭活疫苗见表1L22o2弱毒疫苗2.1自然分离弱毒株最早使用的禽大肠杆菌病弱毒疫苗为活的无毒株或致弱毒株。1980年,Arpg用APEC（）78:K1活疫苗肌肉或气管滴入免疫7和14日龄火鸡，24日龄时用108CFU同源菌株静脉攻毒，与未免疫组比较，7管

39、接种组的死亡率降低了88%、肌肉接种组降低了77%。虽然免疫组降低了死亡率，但攻毒后24d存活的多数火鸡表现有败血性多滑膜炎。1994年，Frommcr等田们用一株分离白肉仔鸡粪便的活的含菌毛非致病性菌株BT-7（血清型064）分别对于1、7、】4和21日龄肌肉免疫的肉鸡，28日龄攻毒，结果发现14或21日龄免疫较1或7日龄免疫的仔鸡保护更坚强.其原因可能是由于母源抗体干扰和/或免疫器官不成熟而对抗原刺激不能产生有效的免疫应答。经不同途径（肌肉、喷雾、饮水）和接种次数（1或2次）免疫肉仔鸡，结果表明，21日龄免疫后1周肌肉攻毒O1:K1、O2:K1和（）78:K80至少保护2周。在7和21日龄

40、经饮水或肌肉途径2次免疫的仔鸡与在21龄经相同途径1次免疫的仔鸡，其保护率相当，而喷雾免疫的仔鸡缺乏明显的保护mJ。2.2化学致弱毒株1985年.Nivas等板将口丫呢橙处理过的一种光滑型耐链毒素078菌株作为疫苗（24h肉汤培养物）气雾免疫事先暴露于氨气和不暴露氨气的2周於火鸡，结果表明未暴露氛气组的火鸡可有效清除肺脏和其他内脏的细幽，而暴露于氛气组的火鸡与对照组相比无显著差别。同年，Naveh等26】利用亚硝酸增殖含有LPS核心（LPS核心为多数肠道致病菌共有，其抗体可提供广谱保护）但不能生物合成。抗原多糖的大肠杆菌K-12粗箱型突变株（LR2）.将此突变株给鸡接种IOCFU亦无毒力，但接

41、种鸡可通过激活巨噬细胞和吞噬细胞诱导产生非特异性免疫。此疫苗可经7雾和饮水及喷雾等不同方法进行群体免疫。用单剂量免疫535日龄的雏鸡.可对（）2和（）78气管攻毒提供保护达20d02.3原生质体融合致弱毒株黄青云等28选取常见的（）2和（）78APEC菌株，分别以氟哌酸和氯霉索诱导，培育成遗传性稳定的耐药标记弱毒菌株O2（NorChr）和O78（ChlNorD,进一步以其作亲本.通过原生质体融合技术培育成功具有双抗药性和双抗原性的融合双价弱毒菌株O2/O78（orChV）,通过AA鸡安全试验及免疫试验证明其安全，免疫原性优良。提取其外膜蛋白（OMPs）分别免疫小鼠和鸡均产生对（）2和（）78良

42、好的同源及异源交叉保护为研究通用安全的APECOMPs疫苗提供了科学依据。2.4基因工程致弱毒株通过基因工程技术可精确地将APEC中参与代谢或致病基因敲除而制备疫苗是H前疫苗研究的新领域。Kwaga等网将APEC。2菌株编码精氨酸和嗜呢代谢作用的酶基因carAB敲除制备突变株弱毒疫苗，将此突变株5X10*和7X1O5CFU）皮下接种1口龄雏鸡证明安全。口服免疫4周龄火鸡后1周，可抵抗出血性肠炎病毒A和（）2野生菌株的联合气管攻毒。免疫火鸡未观察到任何病变，而未免疫火鸡攻毒后的死亡率和病变率分别为40%和52%,但此疫苗对异源菌株攻毒或肉鸡使用效果如何未见后续报道。Peighambari等通过类

43、似的途径构建了APEC02和（）78cyacrp突变株。通过单剂峨和双剂量喷雾免疫肉仔鸡以确定其安全性、免疫原性和效力。通过对14和21日龄肉仔鸡喷雾20液滴野生型大肠杆菌、突变株（左cya/crp）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）确定疫苗的安全性和免疫原性。02和078突变株免疫接种鸡不引起死亡或肉眼病变。接种突变株和野生菌株的肉鸡血清IgG和气囊洗液IgA水平显著高于PBS对照组。用（）2或免疫日龄Ageofimmunization攻毒Challenge保护效果Effect,表1禽大肠杆菌病灭活疫苗Table1Inactivatedvaccinesofaviancolibacillosisa,+

44、,表示保护，一，表示不保护；b,加入弗氏完全或不完全佐剂的2种组方具有保护性;c,攻推免疫0鸡孵出的辎鸡疫苗株血清型Vaccinestrainserotype灭活方法Inaclivatcdmethod接种途径Routeofdelivery初免(d)1st二免(d)2nd途径Route日龄(d)Age同源攻祢Homologouschallenge异源攻毒Heterologouschallenge078K80乙醇、丙咽、福尔马林、加热皮下、肌肉、腹腔21未进行肌肉42、49、56+b02:KI乙静、丙酮、福尔马林、加热皮下14.21未进行皮下35或42+b078K80加热、福尔马林肌肉714静豚2

45、4+未试验O1KI福尔马林颈部背侧皮F28或3542或49后胸气囊56+()1/02/078福尔马林肌肉114未试验28+未试验()2:KI超声、加热、福尔马林、辐射皮下10未进行皮下20+十()78：K80超声、加热、福尔马林、辐射皮下10未进行皮下20+J5-加热静脉5、14、20未进行静脉28可能有效可能有效02：KI超声皮下、肌肉未进行未试验皮下未进行-未进行()2/035/078福尔马林皮下。140175气管14-078K80菌蜕肌肉、口服1来知21+未进行a,4.Indicatedprotective.Indicatednotprotective；b,Bothformulaswer

46、eprotectiveonlywhenincorporatedwithFreundscompleteorincompleteadjuvantjc.Henswereimmunizedandhatchedchickswerechallenged078疫苗株免疫14d和用02疫苗株免疫10和14d的肉仔鸡，免疫后10d用原始毒株攻毒。结果免疫组和对照组之间局部IgA和IgG,血清IgG应答无显著差异。用02而非（）78疫苗株免疫的雏鸡气囊损伤等级显著低于未免疫组。通过精准缺失突变技术.Kariyawasam等狗构建了3种生物合成基因突变株，即RalE（编码LPS合成所需的尿哓噬核甘二磷酸盐半乳糖差向

47、异构酶）、编码瞭吟生物合成所需的腺甘酸琥珀酸合成酶）及。A基因（编码对氨基苯甲酸、芳香族氨基酸和叶酸生物合成的中间产物-分支酸）。用此3株突变株气雾免疫1和14日龄的推鸡表明安全、无毒并能保护同源菌株气雾攻毒，但对异源菌株攻毒无效，其中株不及其他两株有效。Salchi等33也证实“A突变株（）78:K80免疫1和】4日龄惟鸡不能产生抗体应答，对同源和异源菌株攻毒无效并导致试验鸡气囊、肝脏和心包的病理变化，旦免疫的肉鸡与对照组相比体重减轻。新近的研究表明疫苗是通过细胞介导免疫而非循环抗体获得保护S此外，Nagano等功通过等位基因交换构建了基因缺失疫苗，该疫苗株失去r色氨酸脱氨酶活性、缺乏吸附刚

48、果红的能力、不能发酵除葡萄糖和L-果胶糖以外的糖类，亦不携带4种已知的毒力基因（iss、ish、cvaA、papC）。通过喷雾和点眼及胚内接种可激发对野生毒力型APEC（）78攻毒的有效免疫应答。特别是经此疫苗免疫后，通过静脉攻毒，与对照组相比,死亡率、临床和器官损伤等级及攻毒偏株回收率均降低。其优点是接种19日龄的鸡胚，其出锥率及勺隹鸡存活率不受影响，虽然自免疫雏鸡回收到了少量的攻毒优株。这种接种途径对家禽业逐渐广泛使用的胚胎免疫具有更大价值。令人不可思议的是很多在试验条件下证明安全有效的APEC弱毒疫苗株为何没有商品化？其原因除存在非特异性突变和毒力返强的可能外，或许与其“毒力太弱”以至于

49、不能在体内存活足够长的时间以激发坚强的免疫应答有关。即使已商品化的疫苗PoulVac仍需进一步在田间条件下观察。然而,与必须进行个体免疫的灭活疫苗相比，弱毒疫苗更适用于现代规模化芥殖场群体免疫的需求，这或许是吸引众多研究者深入研发此类疫苗的关键所在。目前研发的APEC活疫苗见表2223亚单位疫苗3.1菌毛疫苗抗菌毛抗体可阻止APEC黏附宿主细胞表面口们。据此,Gyimah等丈研发并试验了抗鸡大肠杆前病的Ol：K1菌毛油乳剂疫苗。疫苗含南毛蛋白116或29pg,分别在4和6周龄皮下注射2次。8周龄时后胸气囊内注射同源APEC攻毒。与未免疫对照鸡相比，免疫鸡死亡率、病变损伤程度及内脏细萌回收率显著

50、下降。随后.该组作者又研发了包括3种最常见血清型（01.02和078）在内的多价菌毛疫苗，每种血清型菌毛蛋白为180gW、该疫苗经皮下接种4和6周龄鸡，2周后攻毒，与对照鸡相比,免疫鸡对（）1、。2和078菌株所致的损伤等级显著降低。vandenBosch39研究了自鸡大肠杆菌病分离并于琼脂培养基上生长的APEC萌株Fl1菌毛的表达。对大量收集的菌株筛查结果表明所有检测的APEC.78%的菌株及属于禽大肠杆凿病中最常见的血清型（）18K1.O2:K、035和078:K80）的96%APEC菌株均表达F11菌毛。F11菌毛用于免疫肉种母鸡，其抗体应答通过ELISA检测。免疫母鸡孵出的仔鸡于3周龄

51、用（）1:K1.O2:Kl、（）15：K14.O35:K-或078:K80APEC气囊内攻毒，结果高达85%的雏鸡获得保护。用静脉接种制备的F11家兔抗血清静脉被动免疫接种3周龄肉仔鸡，随后气囊内注射同源或异源APEC攻毒。除（）1:K1外，雏鸡对其他所有血清型都获得保护。Kariyawasam等如用PapG或FimH菌毛黏附索免疫肉鸡纯化的IgY肌肉注射11日龄肉仔煽，3d后免疫鸡用同源078APEC（纯化菌毛蛋白用曲株）或异源APEC（）1和（）2）气囊内攻毒以评估被动接种菌毛黏附素抗体的效力。接种抗PapGIgY的雏鸡对同源和异源APEC攻毒获得保护.而接种抗FimHIgY的雏鸡对同源和

52、异源APEC攻毒不能保护。Vandemaele等叫将PapGII等位片段肌注1C日龄维鸡后可诱发强烈的体液IgY应答。24d后,用2.7X10,CFU/mL培养物气囊或喷雾攻毒，其保护与非免疫对照组比较无显著差异。由于未对呼吸道黏膜表面IgA进行检测，故很难得出PapG等位片段无保护的结论，因为非正统的投给方法却可诱导产生黏膜免疫。3.2英膜多糖细前的荚膜多糖能抵抗巨噬细胞的吞噬作用,从而影响其他表面抗原的免疫应答。故可利用荚膜多糖制备亚单位疫苗免疫鸡，产生抗体以消除其抗吞噬作用，达到防御大肠杆菌侵袭的目的。虽然国内外均有报道，终因其制备成本高、效果一般，故实际应用价值不大。Table2Liv

53、eattenuatedvaccinesofaviancolibacillosis疫苗株Vaccinestrain接种途径Routeofdelivery免疫日龄Ageofimmunization攻毒Challenge保护效果Effect初免（d）1st二免(d)2nd途径Route日龄(d)Age同源攻毒Homologouschallenge异源攻毒Heterologouschallenge经町呢橙处理的078前株Acridineorange-treatedpathogenicE.coli078喷雾14未进行喷雾28未试验未修饰的非致病性菌株078Unmodified,nonpathogenic

54、E.coli078气管714静脉28+未试验氧化氮处理的K12(LR-2)Nitrousoxide*treatedE.coliK12(LR-2)气雾、饮水5-35未进行气管25未进行+未修饰的非致病性菌株(BT-7)Unmodified,nonpathogenicE.coli(BT-7)肌肉14或21未进行气雾28未进行十02/078(NorrChlr)肌肉10未进行肌肉24十十carAB口服28未进行气管32未试验cyacry*气雾、口服114气管284-未试验cyacry气雾14未进行啧雾24+未试验galE气雾114喷雾21十purE气雾114喷雾21aroA雾114喷雾21+气雾、点眼

55、432静脉46+未试验鼠伤寒沙门氏幽突变株表达的APEC抗原*cyacry,SalmonellatyphimuriummutantexpressingAPECantigens3.3铁调控外膜蛋白（IROMPs）用家兔抗大肠杆菌Olli73ku铁肠杆菌素受体蛋白的多克隆抗血清筛检的17株致病性和非致病性大肠杆菌中，发现肠菌素（enterobactin）受体的分子质量和抗原特性高度保守3】。这种特性使得肠菌素受体或其他IROMPs可作为潜在的APEC候选疫苗株。用家兔制备的抗IROMPs（自大肠杆菌078:K80:H9提取）血清静脉接种被动免疫18日龄火鸡，2h后，腹气囊接种同源大肠杆菌（1X106或2X10。CFU）攻毒，接种火鸡获得保护，无死亡率，而注射正常家兔血清和生理盐水的对照组死亡率为此外，免疫组于攻毒后96h的菌血症降低，气囊回收大肠杆菌减少及攻毒火鸡肉眼病变程度减轻。气菌素（aerobactin）是肠杆菌科产气菌素细菌产生的一种铁载体。LeRoy等用铁气菌素联合福氏完全佐剂间隔7d免疫种母鸡，采用ELISA方法检测出壳雏鸡的抗铁气菌素特异性抗体是否转移。出壳后立即用10倍系列稀释强毒力产气菌素大肠杆菌（）78菌株的过夜培养物攻毒，未见明显保护。虽然母鸡产生的抗体不能保护其子代，但试验再次表明免疫母鸡可能是对付APEC的一种切实可行的策略.因为特异抗体显著经卵沉积