酶工程复习材料

1、1. 酶生物合成的模式有哪些？哪一种模式较为适合生产的需要？对于其他的合成模式，应如何调节发酵的条件以使其更为趋近于最佳的模式？酶生物合成的模式·同步合成型·延续合成型·中期合成型·滞后合成型同步合成型概念：酶的合成与细胞生长同步进行。当细胞进入对数生长期，酶大量产生，细胞生长进入稳定期后，酶的合成随之停止。特点：属于这种类型的酶，其生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和产物阻遏作用。延续合成型概念：酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞生长进入平衡之后，酶还可以延续合成较长的一段时间。特点：这种类型的酶可受诱导但不受分解代谢物阻遏和产物阻遏，其对应

2、的mRNA是相当稳定的。中期合成型概念：酶的合成在细胞生长一段时间以后开始，而在细胞进入平衡期后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受到反馈阻遏，而且其所对应的mRNA 是不稳定的。滞后合成型概念：只有当细胞生长进入平衡期后，酶才开始合成并大量积累。特点：酶的合成受到分解代谢物阻遏作用。 在酶工程生产中为了提高酶的生产率，延长酶的发酵生产周期，酶最理想的生物合成模式应为部分生长偶联型（延续合成型），因为这类酶在发酵过程中没有明显的生长期和产酶区的区别，随细胞生长即有酶的产生，直到细胞生长进入平衡期之后酶还可以合成。对于其他型的酶，要提高酶产率，可以再细胞选育上，工艺条件等方面加以条件控制。对于

3、同步合成型的酶，可以采用适当的生产工艺，如降低发酵温度以尽量提高其对应的mRNA的稳定性；对于滞后合成型的酶，在发酵过程中应设法尽量减少甚至借出分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始, 控制葡萄糖等易利用碳源, 添加一定量的cAMP；对于中期合成型的酶，则要在提高mRNA稳定性和解除阻遏两方面进行。控制末端产物浓度,添加末端产物类似物2. 试以基因调节控制理论说明酶生物合成的分解代谢物阻遏作用、诱导作用及反馈阻遏作用的原理。 基因调节控制理论-操纵子学说分解代谢物阻遏作用是指容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象酶生物合成的诱导作用是指加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过

4、程酶合成的反馈阻遏作用是指酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的合成受阻的过程3. 何为酶电极、酶标免疫测定？酶标免疫测定是指在放射免疫测定的基础上发展起来的一种分析方法，它是将酶作为标记物质，使之和抗原（或抗体）结合形成酶与抗原（或抗体）复合物，然后再根据待测抗体（或抗原）与复合物专一且定量的结合关系，通过测定与待测抗体（或抗原）结合的酶的活力，从而计算出待测抗体（或抗原）的量。酶电极是最早问世的生物传感器，它是把测定无机离子或低分子量气体的电化学器体（如离子选择性电极或气敏电极）与酶固定化技术相结合而产生的传感器，使原来仅有测量物理量功能的电极具备了测量生物化学量的功能，它在生物试样

5、化学成分的检测方面具有良好的选择性和较强的特异性。4. 试以米氏方程说明酶法分析、酶活测定的原理。 酶活力测定（Enzyme Assay）分析对象 酶一般常测定酶促反应的初速度以确定酶活力。酶单位：1961 年，国际生化联合会酶委员会建议，一个酶单位为在确定的最适反应条件下，每分钟催化1 ml分子底物变化所需要的酶量。测定原理:酶法分析（Enzyme Analysis ）分析工具 酶（酶免分析、酶电极）原理：米氏方程：当s << km 时，即反应体系中底物浓度较低，酶量足或过量时，v vm/km.s ，即测定的酶活（反应速度）与体系中的底物浓度成正比，具有线性的比例关系。6. 何为

6、酶工程、抗体酶、半抗原、酶的专一性，酶的分类.Ø 酶工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，它的应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。Ø 抗体酶通过改变抗体中与抗原结合的微环境，并在适当部位插入催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。Ø 半抗原有些小分子化合物（如药物）因其结构简单，本身不是抗原，不能免疫动物，但是当它和蛋白质载体结合后就可以成为抗原，免疫动物因之产生的抗体可以与小分子化合物本身起抗原抗体反应，这种小分子化合物一般称之为半抗原。Ø 酶的专一性是指酶对催化

7、反应和反应物有严格的选择性。被作用的反应物通常叫做底物，酶往往只能催化一种或一类反应，作用于一种或一类物质，一般催化剂没有这样的选择性。酶作用专一性的类型1. 立体异构专一性a) 立体异构专一性(L/D)b) 几何异构专一性(顺/反)2. 非立体化学专一性a)绝对专一性:A Bb)相对专一性 1) 键专一性:A B2) 基团专一性:A -B,A- B酶作用专一性的机制：诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状。（酶的化学本质：蛋白质、 RNA、DNA、抗体酶）Ø 酶的分类1. 氧化还原酶类Oxidoreductases2. 转移

8、酶类 Transgerases3. 水解酶类 Hydrolases4. 裂合酶类 Lyases5. 异构酶类 Isomerases6. 合成酶类 SynthetasesSynthases7.简述酶蛋白的结构特征、酶高效催化作用的原理或机制。Ø 酶蛋白的结构特征：·结合部位Binding site酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。结合部位决定酶的专一性·催化部位 Catalytic site酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。催化部位决定酶所催化反应的性质。·调控部位 Re

9、gulatory site酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。酶活性中心的必需基团主要包括：亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。酸碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。Ø 酶作用高效率的机制:一、中间产物学说在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。E + S = E-S P + E许多实验事实证明了ES复合物的存在。ES复合物形成的速率与酶和底物的性质

10、有关。二、活化能降低酶催化作用的本质是酶的活性中心与底物分子通过短程非共价力(如氢键,离子键和疏水键等)的作用，形成E-S反应中间物，其结果使底物的价键状态发生形变或极化，起到激活底物分子和降低过渡态活化能作用。1.趋近和定向效应趋近效应: 在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；定向效应:另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。2.底物变形与张力学说酶(E)与底物(S)结合后,使底物的某些敏感键发生变形,从而使底物分子接近

11、于过度态,降低反应的活化能;同时,由于底物的诱导,酶分子的构象发生表化，并对底物产生张力作用(多为酶中金属离子引起)使底物扭曲,促进ES进入过度态。3. 共价催化催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。·酶中参与共价催化的基团主要包括His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等。·某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。4. 酸碱催化酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸碱催化方式。广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分

12、质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。广义酸基团（质子供体）广义碱基团（质子受体）His 是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。8.过滤、脱盐及浓缩的主要方法.过滤过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术。其中以各种高分子膜为过滤介质的过滤称为膜分离技术。过滤技术：1粗滤：颗粒直径>2m微滤：颗粒直径0.2 m 2 m 分离细菌、灰尘2膜分离技术：超滤：颗粒直径20 Å 0.2 m 分离不同分子量的物质反渗透：颗粒直径<20 Å 分离各种离子与小分子物质粗滤可分为常压过滤、加压过滤、减压过滤。为了加快过滤速度，提

13、高分离效果，经常需要添加助滤剂。常用的有硅藻土、活性炭、纸粕等。膜分离：加压膜分离；电场膜分离（电渗析、离子交换膜电渗析）；扩散膜分离（透析）：用于酶、蛋白质等大分子的浓缩与脱盐。脱盐可以超滤、透析（扩散膜分离）以及层析法进行脱盐。浓缩酶的浓缩有五种方式：蒸发浓缩、胶过滤浓缩、超滤浓缩、反复冻融浓缩、聚乙二醇浓缩法9.层析的主要方法，简述疏水作用层析、离子交换层析等各种层析方法分离酶蛋白的原理。层析是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的大小、形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分在层析的固定相和流动相之间的分布程度不同而得到分离，又称为色谱分离。·凝胶层

14、析概念：又称“分子筛、体积排阻色谱”，是根据溶质分子量的大小不同而进行分离的一种相色谱技术。·离子交换层析概念：是利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同的蛋白质组分得以分离的方法。原理：离子交换层析是利用电荷间相互作用使不同蛋白质得以分离·疏水层析·吸附层析概念：是利用吸附剂对不同酶蛋白的吸附力不同，而使混和液中的各种蛋白质得以分离的方法。原理：表面积较大的吸附剂，在低PH、低离子强度下吸附，在提高PH、增加离子强度的条件下解吸。·亲和层析概念：是利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的技术。酶与底物，酶

15、与竞争性抑制剂，酶与辅酶之间即是具有专一而又可逆的亲和力的分子对·反相色谱和疏水作用色谱10.纯化表的计算及纯化工艺优劣的评价。11.酶的固定化：概念、方法及固定化工艺优劣的评价。通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用的技术。固定化酶(immobilized enzyme)固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。固定化细胞（immobilized cell）固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。1.吸附法依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。1）物理吸附法

16、（physical adsortion）作用力：氢键、疏水键常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。2）离子结合法（ion binding）作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。缺点：结合力弱，易解吸附。2.共价偶联法借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性3.交联法（crosslinking）借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。双功能试剂：常用

17、的是戊二醛,戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：交联法不使用载体。交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落，可连续使用。缺点：(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便4. 包埋法（entrapment）将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为：网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。与网

18、格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。112.何为盐析沉淀、酶的分子修饰、等电聚焦电泳。盐析沉淀盐析沉淀是利用在弄一浓度盐溶液中，不同的蛋白质和酶的溶解度各不相同的原理，对酶蛋白进行分离的方法。原理：对于含有多种蛋白质或酶的混合液

19、，可以采用分段盐析的方法进行分离纯化。因为在某一浓度的盐溶液中，不同的蛋白质和酶的溶解度各不相同，故可达到彼此分离的目的。酶的分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质等电聚焦电泳概念：在电泳系统中加入两性电解质载体，通以直流电后，两性电解质即在电场中形成一个由阳极到阴极连续增高的PH梯度。当蛋白质、多肽或酶进入这个体系时，不同的蛋白质即移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白质得以分离。良好的载体两性

20、电解质必备的条件13.对于未知蛋白的分离，如何选择恰当的离子交换层析的介质？14.酶的分子修饰的方法有哪些？如何运用蛋白质工程的方法来改造天然的酶分子？分子修饰通过各种方法使酶的分子结构发生某些改变，从而改变了酶的某些特性和方法，以提高酶的活力，增加酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性等的过程，称之。蛋白质工程§蛋白质高级结构预测§利用分子生物学技术方法改造酶蛋白一级结构,进而改造其高级结构酶分子的修饰方法·金属离子置换修饰,·大分子结合修饰(共价/非共价)·侧链基团修饰·肽链有限水解修饰·氨基酸置换修饰·酶分子的物理修饰利用基因工程技术定向改造酶蛋白的结构基因定点诱变（ Site-directed mutagenesi s）PCR 诱变（PCR mutagene