酵母细胞酒精发酵固定化载体的改进_图文

1、食品工业科技S cience and Technology of Food Industry研究与探讨134 2008年第 02期酵母细胞酒精发酵固定化载体的改进宋慧一 , 赵昊璐 , 任蜀豫 , 孙军德 3(沈阳农业大学 , 辽宁沈阳 110161摘 要 :针对海藻酸钠载体强度低 、 易分解的缺点 , 采用添加法和置换法对载体进行改性研究 , 并确定了最佳固定化 条件 。 考察了添加物质的添加量 、 置换物质的浓度、 钙化时间及置换时间对固定化细胞强度的影响 。制备得到的固定 化细胞采用 1%浓度的 A l (NO 3 3置换 , 置换时间 18h 时固定化细胞强度最大。 该固定化细胞可进行

2、 42d 共 14批次的 酒精发酵 。关键词 :酒精发酵 , 固定化细胞载体 , 固定化条件 , 改进Modified technique of i m mobilized carrier on the yeast alcohol fer mentati onS O NG Hu i -y i , ZHAO Hao -lu, REN Shu -yu, SUN Jun -de 3(Shenyang Agricultural University, Shenyang China Ab s trac t:T w o d iffe re n t m e thod s, a d d iti on a nd

3、 d i sp la c em e n t w a d s o a s i m s ng th of c a l c i um -a l g ina te b e a d s, a nd the b e s t i m m ob ilize d c s d 1c p rop o rti ons of m od ifie rs, c onc e n tra tion of d i sp la c i ng s ub s ta e, i fic a ti a l c ti m e on the i m m ob ili ze d c e ll w e re i nsp e c te d 1The

4、s tre ng th of m d s re a xi m a l va lue a fte r the i m m ob ilize d c e ll s w a s d i sp la c e d b y m a s s fra 3 3a lc ifie d fo r 18h 1The i m m ob ilize d c e lls c ou l d b e us e d fo r the a l c oho l fe r m e n ta tion d, a he s on a ve ra g e 1Key wo rd s:a lc l r m e n ta tion; i m m

5、ob ilize d c e ll c a rrie r ; i m m ob ilize d c ond iti on; i m p rove中图分类号 :TS26111+1 文献标识码 :A 文 章 编 号 :1002-0306(2008 02-0134-03收稿日期 :2007-08-06 3通讯联系人作者简介 :宋慧一 (1983- , 女 , 硕士研究生 , 从事微生物发酵研究。 乙醇 (酒精 是用途最广和用量最大的有机溶剂 之一 , 发酵法生产乙醇由于原料来源广泛 , 公认为可长期持续供应的可再生能源 1。 近年来 , 由于固定化 细胞技术的兴起 , 使高细胞密度的高速率发酵成为

6、可能 。 国内外学者将该项技术用于酒精发酵已作了大量研究 , 并取得了不少有益成果 2, 有效地解决了 传统的酒精发酵生产中存在的发酵周期长 , 发酵液 中酵母细胞密度低 , 发酵液中乙醇对酵母细胞的反 馈抑制等缺点 。做为固定化载体之一的海藻酸钠 , 因具有制备方法简单 、 条件温和 、 无毒 、 不被绝大多 数微生物分解 、 成本低廉等优点成为了较为广泛使 用的载体材料 。 但海藻酸钙凝胶在含多价阴离子的 溶液以及高浓度电解质溶液中不稳定 , 钙离子易脱 落 , 凝胶变软 , 甚至溶解 , 又限制了它的应用 。本文 采用 2种不同的方法对海藻酸钙凝胶进行改进 , 最 后选择铝离子对钙离子置

7、换法 , 将酵母细胞固定 , 经 培养和连续发酵实验 , 海藻酸铝固定化酵母细胞使 用寿命明显延长 。1 材料与方法111 实验材料高活性鲜酵母 安琪牌 ; 酵母细胞培养基 葡 萄糖 2%, 蛋白胨 015%, 酵母膏 013%, pH510; 高密度增殖细胞培养基 葡萄糖 2%, 蛋白胨 015%, 酵母膏 013%, NH 4C l 0113%,M gS O 40101%, CaCl 201006%, pH 自然 ; 固 定 化 增 殖 培 养 基 葡 萄 糖 3%, 蛋 白 胨013%, 酵母膏 0125%, K H 2P O 40125%, M gS O 40101%, CaCl 20

8、1006%, pH510; 发酵培养基 葡萄糖 20%, 酵 母 膏 015%, 蛋 白 胨 015%, NH 4Cl 0115%, K H 2P O 40115%,M gS O 401065%, CaC l 20128%, pH 自然 , 115 灭菌 15m in 。112 固定化细胞的制备3将试管斜面菌种接入液体酵母细胞培养基中 , 在 28 、 100r/min 条件下活化 1d, 再接入高密度增殖细 胞培养基 , 在 30 、 120r/min 条件下增殖培养 18h 。 按 1 3的比例取菌液与海藻酸钠溶液混合 , 用注射器(10# 逐滴注入 CaCl 2水溶液中 , 固化 46h

9、, 用无菌水 将固化后的细胞 (直径 23mm 洗 3次 , 4 备用 。113 酵母细胞固定化条件优化在制备固定化细胞时发现 :海藻酸钠浓度 、 CaC l 2溶液浓度 、 钙化时间和钙化温度对凝胶球的强度有 显著影响 。 所以实验主要考察这 4个因素 , 每个因素取三个水平 , 选择 L 9(34四因素三水平进行正交实验5, 以缓冲溶液中溶解时间为实验指标 。114 固定化细胞强度的改进对于添加的物质 , 以 1%(m /V 的比例将添加剂与菌液和海藻酸钠溶液混合均匀 ; 对于置换的物质 , 要将所得的固定化细胞再置于 1%的置换溶液中置 研究与探讨食品工业科技V ol . 29, N o

10、 . 02, 2008 2008年第 02期 135 表 1 正交实验结果分析表实验号A 海藻酸钠浓度 (% B CaCl 溶液浓度 (%(115 固定化细胞强度的测定4以缓冲溶液中固定化细胞溶解时间测定强度 :250mL 锥形瓶中装 50mL 、 pH710的磷酸缓冲液 , 1g 固定化细胞 , 30 、 150r/min 部溶解时间 。2 211 见表 1, 由表 1可知 :各因素最优水平分别是 A 3、 B 1、 C 2、 D 2, 即 :海藻酸钠浓度是 4%, CaCl 2溶液浓度 115%, 钙化时间 3h, 钙化温度 25 ; 由极差大小可 知 , 影响固定化细胞强度的各因素作用大

11、小顺序是 :海藻酸钠浓度 >钙化温度 >钙化时间 >CaC l 2溶液 浓度 。 从表中还可以看出 , 3%和 4%浓度的海藻酸 钠对固定化细胞强度影响不大 。考虑到成本因素 , 且海藻酸钠浓度越大 , 制备越困难 , 所以选用 3%海 藻酸钠浓度 , 115%CaC l 2溶液浓度 , 在 25 条件下固 化 3h 来制备固定化细胞 。212 添加不同物质对固定化细胞强度的影响在海藻酸钠溶液中添加一定比例的 A l 2O 3、 M g O 、 CaCO 3和 Si O 2, 比较这 4种物质在缓冲液中的溶解时 间 。 图 1表明 , 4种物质中 M g O 的效果要好于其它

12、 物质 , 这是由于 M g O 是碱性化合物和高熔点的离子 晶体 , 在中性溶液中较稳定 , 添加到固定化细胞中 , 可以明显增加固定化细胞强度。图 1 添加不同物质对固定化细胞强度的影响213 M gO 剂量对固定化细胞强度的影响从图 2中可以看出 , 随着 M g O 质量分数的增加 , 当 M g O 质量分数 为 1%时 , 320m in; 继续增加 M 添加量 。 M g O 与海 , 比例。图 2 Mg O 剂量对固定化细胞强度的影响214 不同置换物质对固定化细胞强度的影响此方法是将制备好的固定化细胞再置于一定浓 度 的 置 换 剂 溶 液 中 置 换 18h 。实 验 选

13、用 ZnS O 4、 CuS O 4、 M nS O 4、 FeS O 4、 A l (NO 3 3和 A l C l 3做为置换物 质 , 结果见图 3。用 ZnS O 4、 CuS O 4、 M nS O 4、 FeS O 4均 可以增加固定化细胞的强度 , 但增加作用不明显 。 而采用铝盐做置换剂可以大幅度的提高固定化细胞 耐缓冲液腐蚀的能力 , 尤其以 A l (NO 3 3效果最好 。 这主要是因为 A l 3+把 Ca 2+从海藻酸钙中置换出来, 磷酸盐对海藻酸铝的固定化细胞破坏性减小 。图 3 不同置换物质对固定化细胞强度的影响215 置换时间对固定化细胞强度的影响从图 4可知

14、, 在置换溶液中置换 18h 得到的固定化细胞强度最大 , 可达 310m in 。 随着置换时间的延 长 , 固定化细胞的强度保持恒定 ,没有明显增加 。 食品工业科技S cience and Technology of Food Industry研究与探讨 136 2008年第 02期图 4 置换时间对固定化细胞强度的影响216 固定化细胞发酵生产酒精为了最后确定哪种方法更适于酒精发酵 , 在正交实验结果的基础上 , 将两种方法制成的固定化细 胞按 1 3的比例接入发酵培养基 , 28 、 130r/min 进 行酒精发酵 , 以正交实验结果制备的固定化细胞为 空白对照 。 3d 为一个批

15、次 , 发酵结束后收集发酵液 , 测定酒精体积分数 。 固定化细胞重新接入新鲜发酵 液 , 如此重复 , 直至固定化细胞破碎 。结果表明 , 采 用改进的方法后 , 固定化细胞的寿命有了显著的提表 2 改进方法酒精发酵结果比较 空白添加 Mg OA l (NO 置换使用时间 (d 153942酒精含量 (%, v/v 1310131819残糖量 (% 01714高 , 且产酒率提高了 018%。其中 , 置换法要好于添 加法 , 可以连续使用 42d 共 14个批次的酒精发酵 。 而对照固定化细胞 , 在使用 5个批次后便发生溶解 。3 结论311 考虑到成本和制备的难易程度 , 海藻酸钠浓度

16、3%, CaC l 2溶液浓度 115%, 钙化时间 3h, 钙化温度 25 的条件下 , 得到的固定化细胞强度最大 。312 采用添加和置换的方法均可以显著提高固定化细胞的使用寿命 , 采用添加 1%的 A l (NO 3 3可以获 得最长的使用寿命 , 可以连续使用 42d 以上 , 且酒精 产率增加了 019%。参考文献 :1王健 , 袁永俊 , 等 1利用活性干酵母进行固定化酵母酒精发酵的研究 J 1四川食品与发酵 , 2006(6 :1712何秀良 , 段俊英 , 等 1固定化细胞技术发酵玉米醪生产酒 精的研究 J 1微生物学杂志 , 1998 :242613林海 , , 等 究 1

17、, 124:8014(学 福建 :, 20011, 王志和 , 等 1生物统计学 M1北京 :科学出版 社 , 200211491531(上接第 133页 13倍的粉末状香辛料 的赋味效果 ; 而且在相同的时间内 , 吸附型复合香辛 料较粉末状香辛料更易入味 , 更适合不需烹调或烹 调时间短的场合 ; 此外 , 吸附型香辛料口感饱满细 腻 、 无渣滓 , 不会对加香产品造成质地不均和麻点 。表 6 对比实验结果指标 对比样品吸附型香辛料制得的卤蛋 市售五香粉制得的卤蛋 色泽 卤蛋特有棕色 ; 蛋壳表面 洁净 ; 蛋黄变色 淡棕色 ; 蛋壳表面附有浮沫 ; 蛋黄未变色 气味 五香卤蛋特有气味 ,

18、 浓郁 五香卤蛋特有气味 , 比较淡 滋味 五香卤蛋特有滋味 , 浓郁 五香卤蛋特有气味 , 比较淡 口感饱满细腻 、 无渣滓口感 渣滓口感3 结论将 “ 五香粉 ” 传统配料桂皮 、 八角茴香 、 花椒 、 小 茴香 、 生姜的油树脂产品吸附于载体糊精上 , 制成具 有 “ 五香粉 ” 特色的吸附型复合香辛调味料 。 通过选择检验感官评定法确定了复合油树脂在 吸附型复合香辛料中的最佳含量为 3175%, 以其作 为配方设计时感官评定的复合油树脂含量 。 在实际 应用中 , 其适宜含量为 3%10%。采用 S A S 软件带约束的混合设计 , 以感官评分 为指标 , 确定出五种油树脂占复合油树脂的最优配 方为 :桂皮油树脂 23183%、 八角茴香油树脂22167%、 花椒油树脂 18167%、 小茴香油树脂 1915%、 生姜油树 脂 15133%。 此时 , 感官评分预测值 Y=31193, 即一 般略偏喜欢 。分别采用最优配方制得的吸附型复合香辛料和市售 “ 五香粉 ” 制作五香卤蛋 , 经简单描述感官评定 , 结果表明少量吸附型香辛料即可达到相当于其 13倍的粉末状香辛料的赋味效果