生物化学及分子生物学实验考试

1、一、 实验原理步骤：1、 分子克隆总流程：分子克隆：在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。流程：（1）带有目的基因的DNA片段的获得PCR引物设计，PCR获得。（2）重组DNA分子的构建与载体酶切连接。（3）重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选转化，培养，筛选（4）检测菌落PCR检测，粗提质粒检测，酶切检测，精提质粒，测序。2、质粒DNA的提取及鉴定碱裂解法

2、原理：根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。 在，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。 当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。步骤：1、细菌培养和收集 将3ml含Kan的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37振荡培养过夜。（已完成） 取2.5mL培养物倒入微量离心管（E

3、P管）中, 10000rpm离心1min，吸去培养液。2、细菌裂解及质粒的提取 将细胞沉淀悬浮于100ul溶液I中,充分震荡混匀。 加200ul溶液II(新鲜配制),盖紧管盖,轻轻混匀内容物,将离心管放冰上5min。 加150ul溶液III(冰上预冷),盖紧管口,轻轻颠倒数次使混匀。冰上放置10min。 12000rpm离心10min,将上清转至另一EP管（作好标记）中。3、质 粒 的 纯 化 向上清中加入等体积（450ul）酚:氯仿(1:1) （注意下层是有机相）,反复混匀。 12000rpm,离心2分钟,将上清小心地转移到另一离心管（标记！）中 加入等体积（450ul）氯仿:异戊醇 (24

4、:1),反复混匀。 12000rpm,离心2分钟，取上清液于新的EP管中。4、质粒的浓缩 加入2倍体积（900ul）无水乙醇,混匀后,室温放置10-15min。 12000rpm离心5分钟，倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀, 振荡并离心, 12000rpm离心2分钟，倒去上清液, 空气中干燥510min。5、质粒的溶解和保存及电泳检测 加20ul TE缓冲液,其中含有100ug/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解。 -20保存 1%胶，恒压150V,电泳10-20分钟要点：载体定义：基因工程中携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。类

5、型：大肠杆菌中的质粒、l噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体及动、植物病毒载体等。条件：复制子、咸志梅单一识别位点、标记基因、适合的拷贝数 碱解法、煮沸法（cDNA、pDNA变性、复性不同） 苯酚抽提法（酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布） CsCl法（EB插入造成DNA浮力密度不同） SDS 裂解法（高盐浓度下大分子沉淀，质粒在上清） 玻璃纤维膜法(试剂盒)EDTA螯合Mg离子，抑制DNA酶活性，3、质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测原理：DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。 在一定的电场强度下, DNA

6、分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离分子质量相同,但构型不同的DNA分子。超螺旋 线型 开环步骤：1、酶切：无菌ddH2O 4 l 1 10xbuffer O 1 l 2 质粒DNA 3 l 3 BamHI 1 l 4 NotI 1 l 5 总体积 10 ul混匀后,点动（Short）离心， 37酶切60分钟2、制胶1%，上样，电泳4、目的基因片段的回收玻璃纤维柱法原理：利用特殊硅基质材料，在一定高盐（消除DNA 和硅基质的负电排斥）缓冲系统下高效、专一地吸附DNA的原理（DNA磷酸基团与基质硅烷

7、醇基团形成氢键），配备设计独特的离心吸附柱式结构，快速高效回收DNA片段。步骤1、110V ，1%胶电泳分离2、 切胶，12000离心1min3、 纯化：溶胶:估计凝胶的体积,按照100µl胶加入500µl的溶胶液(Gel-lysis Buffer 溶胶液,6M NaI)65水浴溶胶,其间偶尔摇动,至胶完全溶解(熔胶要充分) 装柱: 将溶液冷却至室温,装柱(做标记),10000rpm离心30秒,滤液可以重新上柱,重复离心一次后弃滤液 漂洗：500µL漂洗液(Washing Buffer漂洗液,含75%乙醇)漂洗,12000rpm离心30秒,去掉废液 重复漂洗：重复

8、漂洗一次,弃废液 干燥：再12000rpm离心2min(离心要充分,彻底去除乙醇) 洗脱:在柱子中央加入120µl洗脱缓冲液(elution buffer)或ddH2O,室温放置2分钟,转入新的EP管中(标记),12000rpm离心1分钟,收集滤液 沉淀:向滤液中加入15µl的3MNaAC溶液,混匀,然后再加入270µl的无水乙醇,-20保存备用(下次实验材料)5、大肠杆菌感受态细胞制备及连接产物的转化原理：l 感受态（Competence)： 细菌处于容易吸收外源DNA的状态l 转化（transformation)： 异源DNA分子导入受体细胞的过程l 致敏过程

9、： 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作在0的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。筛选：抗性或蓝白班：又称蓝白斑筛选法，质粒上LacZ基因编码的肽链与受体菌中编码的半乳糖苷酶C端突变体互补，形成有功能的半乳糖苷酶，在特定培养基上显蓝斑，这种现象称为互补。如

10、果有外源DNA片段插入质粒上的LacZ基因中，则半乳糖苷酶失活，显白斑。步骤：（1）、大肠杆菌DH5感受态的制备1、接单菌落到5ml LB液体培养基中，37、190rpm振荡培养过夜。2、1%（50 µl) 菌液接种到含5 ml LB的试管中，37 振荡培养1-2小时，至。（已完成）3、将1.5mL菌液转移到离心管中。4、离心 5000rpm，4，3min。5、倒出培养液上清。6、用冰预冷的1ml 0.1M的CaCl2处理、轻轻悬浮细胞。7、冰上静置20min。8、5000rpm，4离心5min，倒出上清。9、100µl CaCl2轻轻悬浮，冰浴待用。 （2）、质粒的转化1

11、. 100µl的感受态细胞分成2管(50µl/EP管)2. 实验样品: 将2µl质粒DNA加入到50µl感受态细胞EP管中，用枪头轻轻混匀(勿吹打)（标记P+）3. 阴性对照：将2µl无菌水加入到50µl感受态细胞EP管中，用枪头轻轻混匀(勿吹打)（标记P-）4. 冰浴20min5. （热击）42，90sec，静置，勿摇动6. 迅速放到冰上,冰浴2min7. （复苏）加入950µl LB液体培养基（无抗性），标明组号，37，200rpm摇床培养30min8. 连接产物转化管：4000rpm离心5分钟，吸出弃去800uL上清液

12、后，轻轻混匀菌体，将剩余200uL菌液均匀涂布在Kan平板上。 （注意编号!）37培养6、菌落PCR鉴定重组克隆子原理：聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction, PCR 在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增一段目的基因的技术。以单链DNA为模板、4种dNTP为底物,在模板3末端引物存在的条件下,利用酶进行互补链的延伸。经变性、退火和延伸多次循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。Ø 变性：双链DNA解链成为单链DNAØ 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合Ø 延伸：以目的基因为模板,合成互补的新DNA链 (延伸

13、时间：1kb/min)步骤：1、DNA模板的制备(挑取细菌沉淀)2、引物设计与合成(教师已做)3、PCR扩增GFP基因4、琼脂糖电泳检测，1%胶，110V7、重组克隆子的酶切鉴定原理：试剂盒抽提质粒，用限制酶切割，琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段。步骤：1、挑选阳性克隆子培养(已做)2、抽提质粒 1.5-5ml过夜培养菌液,倒入EP管中(标记), 10000rpm离心1min,弃上清。 加入250µl 溶液I（含RNase A），充分混匀。 加入250µl 溶液II，轻轻混匀，室温放置2min。 加入350µl 溶液III，轻轻混匀，13000g离心10m

14、in。 将上清液转移至纯化柱中（标记），13000g离心1min，倒去收集管中的流穿液。 在纯化柱中加700µl DNA漂洗液（含70%乙醇），13000g离心1min，倒去收集管中的流穿液。 重复步骤6。 再次13000g离心2min,用于干燥纯化柱。 丢掉下层收集管，将纯化柱放入新的1.5ml EP管（标记）。 小心加入30ul 50-60度预热的Elution Buffer（T buffer or 纯H2O）（要加到柱子正中间，是液体均匀扩散到DNA吸附填料上），室温放置2min，13000g离心1min，下层新EP管中液体为所纯化的质粒DNA。3、酶切分析，10ul体系4、电

15、泳鉴定，1%胶，110V8、转化BL21同DH59、蛋白质的诱导表达原理：E.coli BL21(DE3)：DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的噬菌体lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，即T7基因不表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。步骤：1. 原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中。2. 挑取单菌落于2mL Kan+ LB培养基培养过夜。(已做)3. 以5%的比例转接于20mL Kanr LB培养基中

16、(加20µLKan)，培养约1小时至约OD600，即可开始诱导目的蛋白的表达。4. 取1.5mL菌液,制样作为未诱导对照。5. 三角瓶中加入IPTG 20µL(0.2M)至终浓度为0.2mM，继续培养。取样：分别于培养后，40min，80min,120min取1mL菌液制样。(0min样品处理一致)制样： 12000rpm离心1min,去掉上清。 加入25µL ddH2O,重悬(充分分散细胞)。 加入25µL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀。 沸水浴5min(蛋白质变性),取出后立即置于冰上。 冷却后,冰箱冷藏,备用。待纯化样品的收集和制备：l

17、 收集10ml诱导好的菌液（180min）于15ml 离心管中，5000g离心5min。l 倒掉上清液，用1.0ml lysis buffer（洗涤缓冲液）重悬菌体，转移至1.5ml离心管。l 10000rpm离心2min，去上清。细菌冻存-20备用。10、蛋白质的纯化原理：亲和层析法his标签和Ni填料 利用his标签和Ni填料结合，利用不同条件洗去杂质，并改变条件将蛋白洗脱收集。步骤：一、收集菌体（已完成）1. 取10mL IPTG诱导3小时的细菌培养液至一支15mL离心管中，平衡，5000g 离心5min，弃上清。2. 用1mL Lysis Buffer将菌体重悬，转移至一个1.5mL

18、EP管中，12000rpm离心1min，弃上清。将菌体沉淀置20冰箱保存。二、裂解细胞1. 将上次保存的菌体取出，室温解冻后加入613uL Lysis Buffer，7uL PMSF（100mM），重悬。2. 向重悬液中加入70uL 溶菌酶（10mg/mL）、7uL RNase A（1mg/mL） 、3.5uL DNase （1mg/mL） ，轻轻混匀后30孵育15min，其间每隔半分钟轻轻摇动一次混合液。3. 15000g离心10min，将裂解上清转移至另一离心管中。三、蛋白纯化1. 向裂解上清中加入 Ni-IDA Resin悬液100uL（注意：吸取前充分混匀），轻柔混匀，冰上放置30min，其间每1min轻轻颠倒一次。2. 将裂解上清与Ni-IDA Resin的混合液转移至一个废旧的DNA吸附柱中。3. 500g “short”离心10s，弃流穿液。4. 向柱中加入600uL Wash Buffer，500g “short”离心10s，弃流穿液。5. 重复第“4”步两次。6. 将吸附柱放在一个干净的1.5mL EP管上，向柱中的Resin加入50uL Elution Buffer，静置2min。500g “short”离心10s。7. 将流穿液重新吸回至吸附柱，重复洗脱2次。可在紫外灯下观察洗脱效果。8. 将吸附柱及Resin交回给老师，洗脱下来的蛋白做