有机溶剂中酶催化活性研究进展

1、有机溶剂中酶催化活性研究进展摘 要：酶在有机溶剂中催化作用的研究日益受到重视，其应用范围也越来越广。 本文就有机介质中酶催化 的影响因素进行了探讨，并归纳出提高酶活性的一系列方法，最后简要介绍了有机溶剂中酶的应用。关键词： 有机溶剂；酶催化一直以来，人们认为“生物催化必须在水溶液中进行 、“有机溶剂是酶的变性剂、失活剂 ，而 1984年，Klibanov提岀：“只要条件适宜，酶在非生物体系的有机溶剂中同样具有催化功能的理论 使酶学概念发生了革命性的改变，并由此开创了非水相生物催化非水酶学的新时代。1 有机溶剂中酶催化反响的优势研究说明，有机溶剂中的酶和水溶液中的酶一样具有高度的底物选择性。此外

2、，还有以下一些特 点2, 3： 1绝大多数有机化合物在非水系统内溶解度很高； 2根据热力学原理，一些在水中不可 能进行的反响，有可能在非水系统内进行； 3有机溶剂可促使热力学平衡向合成方向如酯合成、 肽合成等移动， 如脂肪酶在水中催化脂肪水解， 而在有机溶剂中那么催化酯合成； 4在有机溶剂中， 所有有水参与的副反响如酸酐水解将受到抑制； 5在有机溶剂中酶的热稳定性显著提高，可通 过提高温度加速催化反响进行； 6从非水系统内回收反响产物比水中容易； 7在非水系统内酶很 容易回收和反复使用，不需要进行固定化； 8在有机溶剂中不易发生微生物污染； 9更为重要的 是，低水环境可用于稳定具有未知催化性质

3、的构象异构体，以及在水中寿命极短的酶反响中间体。目前，有机溶剂中酶催化的上述优势使得非水酶学研究成为生物化学、有机化学、生物工程等多 种学科交叉的研究热点。 迄今发现能在有机溶剂中发挥催化功能的酶有十几种， 主要集中于脂肪酶研 究，催化的反响类型包括氧化、复原、酯合成和酯交换、脱氧、酞胺化、甲基化、羟化、磷酸化、脱 氨、异构化、环氧化、开环聚合、侧链切除、缩合及卤代等。2 影响酶催化活性的因素一直以来有机相酶催化的研究非常活泼， 但到目前为止仍处于实验研究阶段， 离工业化应用还有 一定的距离，最大的原因就是酶在有机溶剂中活性较低。一般而言，有机溶剂中的酶活性要比水溶液 中低 2-6个数量级。因

4、此，确定影响有机溶剂中酶活性的因素，设法提高有机溶剂中酶活性表达是当 今酶学研究的重点。有机溶剂中酶的催化必需在其分子周围有一单层水分子直接或间接地通过氢键、 疏水键、静电作 用、范德华力等以维持酶的活性结构，这局部水叫必需水 3，所需水量因酶而异，表示方法也经历了 多个阶段。非水酶学开展初期，普遍采用百分水含量来表示含水量，后来 Halling 4提岀了热力学水活 度aw这一表示方法，因为水解平衡时，各相的 aw值相等；体系的改变伴随着水活度的变化，故通过 aw 值可以推断酶的活性。可通过液上气体与一枯燥柱循环来调节反响介质液上水活度 5；还可采用水 活盐对来控制水活度，这种被普遍采用并行之

5、有效。一些对水比拟敏感的有机相酶促反响如：肽的合成，可用水模拟物代替水，目前常用的水模拟物有甲醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃等，它们对水 敏性酶促反响意义特别大。2.2 有机溶剂一般认为，有机溶剂主要从三个方面来影响酶催化活性： 1有机溶剂影响酶反响过程中底物和产物扩散，从而间接地影响酶活性； 2 有机溶剂“剥夺酶分子外表必需水导致酶活力下降；3有机溶剂直接与酶接触作用，通过破坏维持酶蛋白活性构型的氢键、疏水键等作用，抑制酶活性或使 酶失活。由于溶剂的极性能直接导致酶脱水失活，因此 Colja Laane6 采用溶剂疏水性参数 LogP 值来 评价有机溶剂对酶的影响程度，这一参数广泛使用。何平7等

6、探寻疏水性参数logP不同的有机溶剂对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的影响时发现低logP(logP< -0.24)有机溶剂在低体积分数(10%)时可激活或稳定木瓜蛋白酶及其固定化酶活性，而在高体积分数(x logP< 1.31)有机溶剂对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性具有显著抑制作用；高logP(logP> 1.80)有机溶剂在低体积分数(< 10%)时抑制木瓜蛋白酶及其固定化酶活性，但在高体积分数(30%)时酶活性升高。然而酶的相对反响速率与溶剂 LogP 之间并不呈现线性关系 8。据此， Zhen Yang 等提出分配系数 (Partitioncoefficients ，

7、 P) 作为溶剂选择标准，并发现产物分配系数Pp与底物分配系数Ps比率Pp/Ps与酶相对反响速率之间有良好的线性关系。 分配系数直接反映底物和产物在有机溶剂中的溶剂化， 故作为描述酶在 有机介质中活性是十分有效的。此外，作为有机溶剂变性强度参数变性量(Dena-ture capacity，DC)等也被用于评价有机溶剂对酶活性影响，可见，单一参数无法全面表征酶活性的变化，因此，选择有机 相酶催化的有机溶剂时必须从不同方面来考虑。2.3 酶有机溶剂中，酶的利用形式一般有三种：酶粉、化学修饰酶和固定化酶。Giacomo Carrel等人比较了脂蛋白脂酶以不同形式酶粉、聚乙二醇PEG与酶粉、PEG冷冻

8、枯燥酶粉、PEG共价修饰酶、硅藻土吸附酶 参加甲苯后其酶活性的变化； 结果说明， 酶的形式对酶活性有极大的影响。 其中， PEG 共价修饰酶活性最高，在以乙烯基月桂酸为酰化剂时，其相对酶活性到达100%；硅藻土吸附酶活性为70% ;而酶粉、PEG与酶粉酶活性均小于1%。化学修饰酶由于改变了理化性质，提高了酶的最大 反响速率和酶分子对底物的亲和力从而影响酶的活性 10。用糖脂修饰的 SOD 在有机溶剂中的酶活性 甚至比水中还高。在酶外表涂渍保护膜，降低有机溶剂与酶的直接作用也可起到提高酶活性的作用， 如外表活性剂 11、脂质等。 固定化酶在有机介质中酶活性提高， 为了解释该现象， Kyeong

9、Kyu Kim 12 研究了 B. cepacia产的脂酶的晶体结构，他发现脂酶的活性中心存在一个“盖子覆盖了脂酶的活性 位点，自由酶的活性位点呈现“关闭状态，而被固定化的酶在载体外表呈现“开放的形式，即酶 活中心的“盖子没有覆盖酶的活性位点，酶活就获得了提高。2.4 缓冲液酶冷冻枯燥时的缓冲液对有机相酶催化活性有极重要的影响，缓冲液有四个重要因子：1 pH；2缓冲液类型； 3缓冲液的量； 4水的浓度。通过研究不同pH 条件下冷冻枯燥酶在同一有机溶剂中的酶活性说明，酶在有机溶剂溶液的催化最适 pH 与在水溶液中极为相近。酶在有机溶剂中 的活性取决于其冷冻枯燥前最后存在过的水溶液的pH值pH记忆

10、效应，一般说来，如果冷冻枯燥前溶解酶的缓冲溶液具有酶在水溶液的最适 pH 值, 那么酶的最适离子化状态将会在冷冻枯燥后保 持，在有机介质中表现出来的活性也最大 13。由于不同缓冲液对酶外表微弱的物理效应、在结晶和冷 冻枯燥过程中冰冻水溶液的相行为、 与剩余水之间相互作用、 与酶或底物间相互作用等的不同使得酶 活性在冷冻枯燥后相差上千倍。2.5 盐效应Yuri L. Khmelnitsky 14等研究枯草杆菌蛋白酶在正已烷中的转酯化反响时发现：酶活性随着KCI浓度升高而急剧上升。这种现象在其它酶中也有出现，如A- 胰蛋白酶与 95%KCI 冷冻枯燥， Kcat/Km值可增加 50 倍。学者认为盐

11、诱导酶活性的机理有两个 :盐保护酶免受有机溶剂毒害； 冷冻枯燥过程中， 盐可以保持酶的天然构型。后一种解释被广为接受。 Yuri L. Khmelnitsky 发现，当盐浓度较低时，冷 冻枯燥蛋白酶构成的固体催化颗粒具有疏松结构；当盐浓度较高时，催化颗粒象盐晶体一样，具有刚 性结构，对酶起保护作用。所以，他认为酶在盐基质中之所以保持较高的酶活性，是由于盐基质对有 机溶剂致使酶失活提供一种保护效应。 也有学者认为盐诱导催化活性是由冷冻枯燥时间与酶水含量决 定的。酶活性随冷冻枯燥时间增加而增加，水含量低于最适含量，那么迅速降低。显然不同的催化效率 是基于盐的结合与冷冻枯燥过程双重结果。可见，盐效应

12、机制有待进一步研究。2.6 配体、冷冻枯燥剂、赋形剂 酶在冻干前可用配体、 冷冻枯燥剂为酶作印迹， 使酶以一种高活性构象形式被冻干并在有机介质 中得以保持，这种现象称之为分子印迹。 Alexander M. Klibanov 15 研究了四种蛋白酶和三种脂肪酶与 配体共存的水溶液经冷冻枯燥的酶活性， 发现比没有配体的活力大大地提高。 配体增加酶活性原因在 于:1配体对酶的印迹效应，使得酶的活性构象在固态形式或有机溶剂中得以保持，而由于水的柔 性，印迹构象在水溶液中易失去； 2配体保护酶在冷冻枯燥过程中免受失活。非配体的冷冻枯燥剂 如:山梨醇、木糖醇、海藻糖、甘露醇以及 PEG 等在酶冷冻枯燥之

13、前参加酶水溶液中，也能极大地提 高酶在有机相催化活性， 其作用机制与配体相同。 赋形剂与酶混合冷冻枯燥后也极大地提高了酶活性， 机理是基于赋形剂能缓解酶在冷冻枯燥时失活， 赋形剂所激发的酶活性通过用无水有机溶剂洗掉赋形 剂后消失，这与配体作用机理有所不同。2.7 超声辐射、抑制剂 随着对有机相酶催化的研究深入，所知影响有机相酶催化活性因素越来越多，如:超声辐射、酶抑制剂等。超声波作为一种机械能量形式，可以改变物质组织结构、状态及功能。在适宜的条件下，低强度 的超声辐射对酶有一定的激活作用， 这种激活作用随着时间的增加而愈加明显。 目前利用超声技术对 酶进行处理主要有两种方式：一种是超声预处理，

14、即首先在超声介质中对酶进行超声处理，酶回收处 理后再置于反响介质中进行酶促反响； 另一种是直接对反响介质中的酶进行超声处理， 超声处理与酶 促反响同时进行 16，目前普遍采用的后一种处理方式。 吴虹 17等人在研究超声作用下的酶促废油脂转 酯反响的过程中也报道了反响前对酶进行超声预处理能在一定程度上缩短酶被激活所需的时间， 并使 其充分激活 ,从而加速酶催化反响。具有两亲特性的外表活性剂、胆汁盐、金属离子对酶活性也有一 定的影响，外表活性剂在适宜的浓度下，能促进酶活性及稳定性的提高，而胆汁盐和金属离子在低浓 度时不仅不能提高酶活性，反而在浓度较高时，有显著的抑制作用。这些工作有待进一步深入研究

15、。3 提高酶在有机溶剂中活性的策略如何提高酶在有机溶剂中的活性，促进其在工业界的广泛应用是近年来研究热点。目前，在这方 面已有不少重大突破，根据上述影响酶活性的因素及其造成酶在有机溶剂中活性显著下降主要原因， 并提出了使酶在有机介质中的活性激活的一系列有效方法，其中不少方法本钱低，可按比例扩大，能 使酶反响速度提高 102-105 倍，接近其在水溶液中的酶活性。/颗粒，这些酶粉悬目前，用于有机溶剂的酶制剂通常是从水溶液里经冷冻枯燥制备出来的粉末浮在有机相里，造成底物向酶的扩散受到限制；此外，酶分子互相叠合也容易造成一些酶分子的活性 中心被周围的酶分子封闭， 使底物分子难以靠近。 需要指出的是这

16、种质量传递引起的酶活性下降只能 解释酶在有机介质中活性大幅度下降的局部原因18，可以通过增加搅拌力度和减小酶粉颗粒来缓解质量传递的限制。3.2 优化 pH 状况适当的pH处理可以使酶活性提高100倍。如前所述，我们可以将冷冻枯燥前溶解酶的缓冲溶液 调至酶的最适 pH 值，使酶在有机介质中表现出来的活性最大； 此外，不要使用挥发性的 如甲酸铵 或能溶于有机相的如三异辛胺及其盐酸化物、三苯基乙酸及其钠盐弱酸/弱碱缓冲溶液 18，它们会洗去酶在有机溶剂中表现出来的 pH 记忆效应，从而导致酶活性产生变化。有机溶剂取代水作为反响介质， 使酶分子因缺少水的润滑作用而变得结构更为刚性。 这是造成酶 活性下

17、降的主要原因之一。 向反响体系参加一定量的水分或把体系的热力学水活度aw调节到最正确值，可使酶的反响速度提高 100倍以上13。在某种程度上， 一些能形成氢键的溶剂 如甘油、甘醇 可以取代水提供这种润滑剂作用。 另外， 参加蛋白质变性剂对酶进行适当的前处理也可能使酶的蛋白 质结构因局部展开而变得更加柔韧灵活，从而到达提高酶活力的效果19。长期以来人们认为导致酶在有机溶剂中活性下降的主要原因是酶的蛋白质构型发生变化。事实 上，这种蛋白质变性作用并不是由于酶和溶剂的接触所引起的，而是引入溶剂之前酶的脱水过程如 冷冻枯燥造成的，然而由此产生的变性作用是可逆性的20。为此我们可以将冷冻枯燥后的酶溶解在

18、少量水里，使已变性的蛋白质构型重新恢复，然后再引入有机溶剂中；还可以在冷冻枯燥时往酶的水 溶液中参加某些无机或有机物质使其与酶一同冻干，如无机盐 KCL 、冠醚、环糊精、底物类似物、 冷冻防护剂等 18，这些添加技术有时候可协同作用。4 有机溶剂中酶的应用有机溶剂中的酶由于能催化各种各样的反响， 特别是水溶液中不能进行的反响， 因而极大地扩展 了酶的实用范围。手性研究的热点一般表现在手性药物、绿色农药、高档液晶及高级香料等方面的研究和应用。丛 方地 21以脂肪酶 PSL 和 CSL 作为生物催化剂、辛酸乙烯酯作为酰化剂拆分 2-辛醇，回收率到达 80%。4.2 内酯和聚酯的合成有些通常用化学法

19、难以完成的反响， 如不对称聚酯合成及大环内酯的合成等， 现在可以用有机溶 剂中的酶来完成。随着非水酶学的开展 ,脂肪酶的应用已从油脂水解扩展到酯合成和酯交换，利用这些反响可把廉价的油醋改造成具有食用和医用价值的特殊油脂。郑丽妃 22研究了六种不同种溶剂对阿魏酸酯化反响的影响，筛选岀异辛烷为最正确溶剂，在其最正确的催化条件反响温度为65C，酸醇分子比为1:8 ,酶加量为200mg,反响48小时后到达最高转化率 99%。曾家豫等23脂肪酶为催化剂，正己烷为溶剂，通过酯化反响合成了乙酸薄荷酯，产率高达92.4%。刘虹蕾 24用褶皱假丝酵母脂肪酶在 logP 值为 3.5 的正己烷中高效合成植物甾醇酯

20、。4.4 其他 广泛用于制浆造纸、纺织、食品、化装品、环保、纳米生物技术等领域的漆酶，在不同有机 溶剂体系中已经可以应用于酚、氯酚、蒽、羟基联苯、双酚A 、甾类激素等化学物质的生物转化、木质素的改性、生物合成等方面，这些研究拓展了其应用领域25；同时，非水酶学也促进了其他酶工程相互的开展，如在生物传感器开展过程中，有机相酶电极因其是在有机介质中对物质进行检测，而 受到关注 26。5 总结尽管目前对有机相酶研究还未完善，未到达统一认识，但可以相信，随着研究的不断深入，解决有机酶催化应用问题已为期不远。 有机相酶催化的工业化生产和应用， 将使传统化学工业及其相关工 业朝着节约资源和能源的方向开展，

21、具有广阔的诱人前景。参考文献1 A Zaks A K. Enzymatic catalysis in organic media at 100 degrees CJ. science, 1984,224(4654):1249-1251.2 居乃琥 . 21世纪酶工程研究的新动向 J. 工业微生物 , 2001(01):37-45.3 罗贵民 . 有机溶剂中的酶催化反响 J. 精细与专用化学品 , 1999(05):12-13.4 Rao H. VALIVETY, Peter J. HALLING, Alan D. PEILOW, et al. Relationship betweenwater

22、 activity and catalytic activity oflipases in organic mediaJ. European Journal of Biochemistry, 1994,222(2):461-466.5 Khan S A, Halling P J, Bell G. Measurement and control of water activity with an aluminium oxide sensor in organic two-phase reaction mixtures for enzymic catalysisJ. Enzyme and Micr

23、obial Technology, 1990,12(6):453-458.6 Laane C, Boeren S, Vos K, et al. Rules for Optimization of Biocatalysis in Organic SolventsJ. Biotechnology and Bioengineering, 2022,102(1):2-8.7 何平, 黄家乐, 史清翠, 等. 不同疏水参数有机溶剂中木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的变化J. 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ), 2022(03):223-229.8 Zhen Yang, Robb D A. Partiti

24、on coefficients of substrates and products and solvent selection for biocatalysis under nearly anhydrous conditionsJ. Biotechnology and Bioengineering, 1994,43(5):365-370.9 G. Ottolina, G. Carrea, S. Riva, et al. Effect of the enzyme form on the activity, stability and enantioselectivity of lipoprot

25、ein lipase in tolueneJ. BIOTECHNOLOGY LETTERS, 1992,14(10):947-952.10 刘小林, 李晓婷, 龚国勇, 等. 有机溶剂对多聚半乳糖醛酸酶催化动力学的影响J. 食品科学, 2022(05):134-137.11 宋宝东, 吴金川, 邢爱华, 等. 外表活性剂包衣酶用于催化有机溶剂中的反响 J. 化学工程, 2002(02):45-48.12 Kim K K, Song H K, Shin D H, et al. The crystal structure of a triacylglycerol lipase from Pseud

26、omonas cepacia reveals a highly open conformation in the absence of a bound inhibitorJ. Structure, 1997,5(2):173-185.13 Zhen Yang, Dale Zacherl, Russell A J. pH Dependence of Subtilisin Dispersed in Organic SolventsJ. J. Am. Chem. Soc., 1993,115(26):12251-12257.14 KHMELNITSKY Y L, WELCH S H, CLARK D

27、 S, et al. SALTS DRAMATICALLY ENHANCE ACTIVITYOF ENZYMESSUSPENDED IN ORGANIC-SOLVENTSJ. JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, 1994,116(6):2647-2648.15 Klibanov A M. Why are enzymes less active in organic solvents than in water?J. Trends in Biotechnology, 1997,15(3):97-101.16 赵丹彤, 王萍, 李春元, 等. 超声对有机溶