实验设计大纲范例--肺水肿

1、机能学实验设计大纲实验名称：外源性PS和内源性PS在肺水肿疗效中的比较课题来源：自选设计班级：2004级临床本科甲班设计人员：林静 余英 罗萍 叶娟 胡明娟设计日期：2006年10月8日指导老师：张晓 梁楠成都医学院实验技术教研室2006年制一、实验设计的目的意义：实验设计的目的意义，国内外研究现状，存在的问题，解决问题的思路。目的与意义:复制肺水肿模型，利用直接使用外源性表面活性物质和药物促进内源性表面活性物质释放的方法，比较研究外源性PS和内源性PS在肺水肿中的治疗作用。本实验的目的即在于探讨外源性PS能否在肺水肿的防治中作为一种较为理想的内源性PS不足的替代药物，为临床上治疗肺水肿的联合

2、用药提供一种新思路，具有十分重要的意义。国内外研究现状：任何原因引起肺泡表面活性物质（PS）减少或灭活，均可使肺泡表面张力增加，肺泡过度缩小甚至萎陷，间质负压加大，继而诱发或加重间质及肺泡水肿，临床体外循环后发现，肺含水量的明显增加与内源性PS活性降低有显著的相关性1。肺泡表面活性物质（PS）具有降低肺泡表面张力，维持肺泡稳定性，防止肺胞萎缩，调节肺顺应性，阻止肺毛细血管内液体渗入肺间质和肺泡内，促进肺水的清除等重要生理功能。据相关文献报道，外源性PS能够在一定程度上抑制肺水肿的发生2。张更荣等观察了气管内滴注外源性PS治疗家兔急性肺水肿的疗效，发现伤肺肺含水量明显减少、存活时间显著延长 3

3、。同样应用外源性PS治疗大鼠肺水肿、肺出血实验中也发现肺泡内蛋白质渗出显著减少，肺体指数降低，肺含水量显著降低，肺水肿程度减轻 4.5。诸多资料显示，外源性PS疗法可能成为有效治疗肺水肿的综合措施之一。外源性PS治疗可减轻肺水肿程度，抑制肺水肿形成。目前，内源性PS的产生机制国内已经研究的很透彻了，PS与肺泡型上皮细胞共同构成了PS系统，该系统异常与肺部损伤密不可分，它既是肺损伤的结果，同时也是肺损伤过程中的重要内在因素。肺泡型上皮细胞是合成表面活性物质的主要场所，细支气管非纤毛上皮细胞（Clara细胞）也能分泌少量的PS物质。PS在细胞内质网中合成，通过某种机制转运到高尔基复合体和多囊泡体，

4、然后转运到板层体储存，板层体通过胞吐作用分泌入肺泡腔。肺水肿可导致表面活性物质减少、功能缺陷 6。那么，就目前，一部分药物具有直接恢复肺泡型上皮细胞的生理功能，使其分泌肺泡表面活性物质增多，以达到辅助治疗肺水肿的作用，如：肾上腺糖皮质激素，内皮素-1，盐酸氨溴索等，而其中盐酸氨溴索具有可促进肺表面活性物质的分泌的作用，而对肺水肿没有其他干扰的治疗作用。结合本实验的目的，即探讨外源性PS能否在肺水肿的防治中作为一种较为理想的内源性PS不足的替代药物。利用直接使用外源性表面活性物质和药物促进内源性表面活性物质释放的方法，看那种更具有临床使用价值。存在的问题：目前市场上已有外源性的PS使用，主要用于

5、新生儿呼吸窘迫综合征的治疗。外源性PS目前只局限在实验室证明有治疗肺水肿的作用，还未查见广泛用于临床。解决问题的思路：用快速滴注生理盐水制作动物试验性肺水肿模型。对肺水肿动物分别行外源性PS灌入气管治疗和促内源性表面活性物质释放药，灌入气管治疗，并作实验对照和空白对照。参考文献：1 邢泉生，张善通，陈张根，等.体外循环影响内源性表面活性物质的机制上海医科大学学报，1999，26(1)：132徐建洪 周继红 杨军民.表面活性物质在创伤性肺水肿的作用.中华现代临床医学杂志 2004年5月 第2卷 第5B期3张更荣 王雁 曹勇. 肺表面活性物质防治急性肺水肿作用的实验.江西医学院

6、学报1996；36(1)：17204 金IIb立，徐锦，孙家娥，等应用不同配方磷脂预防大鼠肺出血和肺水肿的研究中华儿科杂志，1997，35(2)：71735 郑珊，张文颖，孙波，等一氧化氮治疗小肠缺血再灌注所致肺损伤的实验研究中华小儿外科杂志，2001，22(3)：1771796 Nitta K，Kobay,hi TIII aim lt of sttrfactant activity and ventilationby protein in lung edemafluidRespirPhysiol，1994，95(1)：43517丁延楷，唐亦奇肺血管外肺水量的重量分析法及其应用中国病理生理学杂

7、志，1987，4：254-255二、实验设计方案（实验设计目标,拟解决的主要问题, 实验动物设计,实验专业设计，实验统计设计,实验方法设计，可行性分析,预期结果，实验设计工作时间安排）。（一）实验设计目标，拟解决的关键问题设计目标：探讨外源性肺表面活性物质和内源性肺表面活性物质对实验性肺水肿治疗作用上所存在的区别，从而探讨外源性PS能否在肺水肿的防治中作为一种较为理想的内源性PS不足的替代药物。拟解决的关键问题：实验模型的制备。对试验性肺水肿的模型进行分组与实验结果分析。（二）实验设计1、实验动物设计我们选用家兔作为实验动物，有以下几点理由：1）、家兔易得到，容易饲养，在科研工作中被广泛利用。

8、2）、家兔肺相对较大，易于得到样品，能在称重过程中减少实验误差。2、实验专业设计选用家兔作为实验动物，给予外源性肺表面活性物质和内源性肺表面活性物质，观察对实验性肺水肿治疗作用，观察兔子死亡时间（min），肺系数（gkg），肺湿干重比（gg），血管外肺水（g）等实验指标。3、实验统计设计实验统计设计中应始终贯彻随机、对照、重复三大原则。（1）随机：选正常成年健康重相近的家兔80只，将80只家兔按体重由小变大编号后，从随机数字表中查取随机数字，依次抄录于家兔编号下。具体方法：动物编号为180号，随机数字从11行第一个数字开始接着抄写80个，按照能被4除的规律：不余到A组，余1到B1组，余2到B2

9、组，余3到B3组，每组20只。（2）对照：本组实验做了空白对照和实验对照，在前面的专业设计里已经提及。（3）重复：本实验采用的是每实验小组有20只家兔，具有一定的重复性。（4）统计数据收集：本实验搜集计量资料，初步确定对各组实验数据的比较分为实验值和基础值比较。表1 实验数据收集记录表编号肺系数（gkg）肺湿干重比（gg）血管外肺水（g）兔子死亡时间（min）AB1B2B3AB1B2B3AB1B2B3AB1B2B3表2四组动物体重及模型形成时间比较（±s）组别模型形成时间（min）兔子死亡时间（min）A （n20）B1（n20）B2（n20）B3（n20）注：基础值比较表3四组动物

10、肺组织含水量测定比较（±s）组别肺系数（gkg）肺湿干重比（gg）血管外肺水（g）A （n20）B1（n20）B2（n20）B3（n20）注：实验值比较（5）统计数据分析本实验采用计量资料来测定各种指标的数值，所有数据均采用平均数±标准差（±s）表示，四组间实验数据比较行完全随机单因素方差分析，组间两两比较行q检验，B1、B2、B3组模型形成时间行两样本比较t检验，均以0.05作为显著性检验水准。实验数据记录如表3。四组间实验数据比较行完全随机单因素方差分析，如各组肺系数总体均值的比较，其方法如下：（1）建立检验假设H0：=（各组肺系数总体均值相等）。H1：、不等

11、或不全相等，0.05。（2）计算统计量 利用统计学专业软件SPSS做One-way ANOVA 。( 3 ) 查F值表，确定P值，得出结论。 B1、B2、B3组模型形成时间行两样本比较t检验，如B1与B2组之间模型形成时间的比较，其方法如下：（1）建立检验假设H0：=（两组肺模型形成时间总体均值相等）。H1：、不等或不全相等，0.05。（2）计算统计量 X=(X1+X2+X3+Xn)/nµ=(Xi-X)2/(n-1) t=（x-u）/Sx( 3 ) 查t值表，确定P值，得出结论。4、实验方法设计实验技术路线家兔 A组假手术组B组 实验组注入生理盐水B3组 注入生理盐水B2组 注入盐酸

12、氨溴索，促内源性ps释放解救B1组 直接注入外源性PS解救肺组织含水量测定肺组织含水量测定肺组织含水量测定肺组织含水量测定实验技术方法（1）随机抽样：随机80只正常的家兔，并分别编号，再随机平分成四组，并称重（实验室共8组同学，1、2组做A组实验，3、4组做B1组实验，5、6组做B2组实验,7、8组做B3组实验。（2）实验分组：（3）实验手术：AB组同时取兔，称重（婴儿秤）后固定于兔台上，剪去颈部长毛（换药碗装水）。用1%普鲁卡因局麻（大约三公分长，不同点局麻），切开颈部皮肤（*轻点，不要损伤气管和血管），呈钝形分离出气管（分离干净），做倒T形切口，插入气管插管并结扎固定，分离颈外静脉，静脉插

13、管。（4）模型复制：B组制造家兔试验性肺水肿模型，从颈外静脉输入37生理盐水，输入量按150ml/kg，输入速度按200滴/min计算，待输液量为总量的2/3时（兔子该输的总量），向管内加入肾上腺素0.5g。输液过程中密切观察家兔的呼吸是否急促和困难，气管插管管口是否有粉红色泡沫样液体溢出。（5）处理措施：1）外源性肺表面活性物质（PS）的提取：取肉联厂新鲜猪肺，洗净肺表面血液，用生理盐水自气管灌入肺内，直到完全膨胀，轻轻拍打后自气管内自然流出灌洗液，若灌洗液呈红色弃掉。每只肺反复灌洗8次，灌洗液回收率85，共6批，每批6个，共36个猪肺。灌洗液合并后在4、1 000×g离心10mi

14、n，去除细胞和组织碎片等沉淀物，取上清液在4 ，10000×g离心40min，得白色沉淀即为Ps粗品，将收集的PS粗品用生理盐水溶解后在4 ，20000 g·0.68、0.25mol/l蔗糖梯度离心30min，取两蔗糖之间的沉淀物，用蒸馏水溶解后同法离心1次，所得沉淀根据F。Ich 方法，用生理盐水溶解后加2倍体积的氯仿甲醇(2/1，V/V)旋涡混匀2min，置4冰箱过夜。然后用7O0 ×g，4离心1 Omin取下相液，N 吹干， 再加冷丙酮于4 ，2000 × g离心10min沉淀，获乳白色物质即为PS纯品。所有操作均在常温下进行，所得PS在4 冰箱保

15、存，Ps加入含005mmol CaCl2的0.1mol生理盐水超声乳化后制成混悬渡，浓度为50gL。2）滴注药品：当家兔出现肺水肿时（有粉红色泡沫样液体时），B1组为外源性PS治疗组，迅速实行气管内注入37PS100mgkg药物解救，B2组为内源性PS治疗组, 同时迅速实行气管内注入3715mgkg盐酸氨溴索葡萄糖注射液，B3组为治疗对照组，同时迅速实行气管内注入同等体积的生理盐水（NS）2.0mlkg。A组为假手术组，在模型复制及治疗相应时间注入同等体积NS作为PS疗效的对照。（6）取材：等家兔自然死亡，并记录其死亡的时间。解剖家兔胸腔，支气管分叉处用线结扎，防止水肿液溢出。结扎处上方切断气

16、管，将肺清理出（把心脏等清除），切勿挤压。（7）肺组织含水量测定：采用重量分析法7肺系数：准确称肺重量，并计算肺系数，肺系数肺重量（g）/体重（kg）肺湿干重比：取左上肺叶称湿重,然后放入烤箱(80 ,48 h) 中烘烤至恒重,再秤干重,计算肺W/D 以评估肺组织的水肿程度血管外肺水：取下右下肺并剪成两半(用2 把止血钳夹住切口,避免肺内液体流出) ,各称湿质量;一半肺即刻剪碎,按1 ml/ 100 mg组织加入生理盐水匀浆,分别测血液和匀浆中Hb的含量,剩余组织匀浆迅速置于- 70 保存备用;另一半肺置于80 烘箱内干燥72 h 至恒质量,称肺干质量;计算公式为:总肺水量指数( TLW) =

17、 (肺湿质量- 肺干质量) / 肺湿质量,每克湿肺含残血量= (匀浆液Hb/ 血液Hb) ×匀浆总样本量×1.055/匀浆肺质量,湿肺含残血量= 肺湿质量×每克湿肺含残血量,EVLWI = (肺湿质量- 肺干质量- 湿肺含残血量) / 肺湿质量。（三）可行性分析:1、家兔易得到，容易侍养，在科研工作中被广泛利用。2、ps提取方法已具备，我们事先自己提取，盐酸氨溴索葡萄糖注射液市场有买，价格不高。3、手术器材和设备均为实验室常用，手术方法我们也相对熟练。（四）预期效果:1、外源性PS能够在肺水肿的防治更具优势，作为一种较为理想的内源性PS不足的替代药物。2、为临床上进一步研制有关外源性表面活性物质的药物提供可靠依据。3、外源性ps可以考虑作为临床上一种联合用药治疗肺水肿。（五）实验设计工作时间安排:1、共计1D 完成