新乡医学院实验课教案首页

1、新乡医学院实验课教案首页课程名称：酶工程 授课教师姓名及职称：闫欣 助教一、授课题目实验一 产木聚糖酶菌株的培养基产酶条件优化及产酶历程二、授课对象2004级生物技术专业本科生三、实验教学目标与课时分配1.了解观察菌株发酵过程中菌体生长变化情况；2.测定不同原料对菌种产酶的影响，确定最佳的产酶条件；3.测定发酵过程中木聚糖酶形成变化情况，确定最佳产酶时间。共12学时。四、授课重点不同原料对菌种产酶的影响五、授课难点发酵过程中木聚糖酶形成变化情况六、授课形式实验课教学，小班分组实验七、授课方法与课前准备讲授、演示了解学生已学课程，及本学期所开课程及具体讲授内容，网上查阅相关资料八、教材与参考文献

2、1.贾新成等。酶制剂工艺学，气象出版社。九、思考题如何根据各种单因素实验结果，确定产酶的最佳条件十、教研室主任及课程负责人签字教研室主任（签字） 课程负责人（签字） 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案课程名称：酶工程 授课教师姓名及职称：闫欣 助教基本内容一、实验目的1.了解观察菌株发酵过程中菌体生长变化情况；2.测定不同原料对菌种产酶的影响，确定最佳的产酶条件；3.测定发酵过程中木聚糖酶形成变化情况，确定最佳产酶时间。二、实验原理木聚糖广泛存在于自然界，是植物细胞壁的主要组成成分之一，其含量仅次于纤维素，通常占高等植物细胞干重的7%-30%，在被子植物中甚至高达30%35%，是自然

3、界较为丰富的自然资源。木聚糖是植物细胞中最具代表性的半纤维素，可以作为再生资源为人类所利用。木聚糖是一种由主链木糖上常以-糖苷键，连接有侧链或分支，不同来源的木聚糖在分子结构上有一定的差异。以-1，4糖苷键连接的D-吡喃木糖为结构主链的复杂多糖，其分子结构如图1，在图 木聚糖的分子结构 Figure:1 The molecular structure of xylan由于木聚糖结构的复杂性，木聚糖的完全水解需要多种酶的协调作用。无论是细菌、真菌还是放线菌中，都有人报道多种木聚糖酶的存在，木聚糖酶（Xylanase）是一类木聚糖降解酶系（如表），对降解自然界大量存在的半纤维素起着重要作用。其降解

4、过程为：首先，由内切-,- D-木聚糖酶（EC3.2.1.8）随机断裂木聚糖骨架，产生木寡糖，表1 木聚糖降解酶系及其作用特点作Table1 1: The system of xylanase and their characteristic木聚糖酶降解体系作用特点,D木聚糖内切酶负责木聚糖的主链骨架的降解,D木糖苷酶负责木寡糖的进一步降解,D葡萄糖苷酶负责木聚糖的支链的降解-L-阿拉伯糖苷酶，-D-葡萄糖醛酸酶负责木聚糖的支链的降解-D-半乳糖苷酶， 脂酶负责木聚糖的支链的降解降低木聚糖的聚合度，然后由外切酶-木糖苷酶（EC3. 2. 1. 37）将木寡糖和木二糖分解为木糖。侧链取代基的存在

5、能阻抑木聚糖酶的作用，因此需要不同的糖苷酶水解木聚糖与侧链取代基之间的糖苷键，如-L-阿拉伯糖苷酶、-D-葡萄糖醛酸酶、乙酰脂酶和阿魏酸脂酶。通过研究揭示，这些特异性糖苷酶能以协调方式与内切木聚糖酶和-木糖苷酶一起高效分解木聚糖。木聚糖酶的生产方法主要集中在黑曲霉、烟曲霉、青霉以及细菌等菌种的液体发酵生产上，通过培养基的优化组合，选择出优质、廉价、高效的产酶培养基，并进行工业化的生产。本实验从液体深层发酵产酶条件优化的角度对一株黑曲霉进行产酶研究，探讨培养基的产酶方案，了解工业化酶工程生产的基本过程。三、材料与方法1 材料1.1 菌种 黑曲霉1.2 仪器超净工作台 1台，接种环 2支，酒精灯

6、1盏，三角瓶（250mL） 60个，搪瓷缸（1000mL） 1个，纱布，棉塞（若干），25 mL容量瓶20个，50 mL容量瓶20个，振荡培养箱 1台，25mL试管若干，分光光度计 1台，离心机 1台，离心管（10mL）10个，胶头滴管 10支，精密酸度计 1台，天平（精确0.0001g和0.01g） 各一台，记号笔 1支，水浴锅 1个，高压灭菌锅 1台，电炉 1个，烧杯50mL、100mL、200mL 各10个，漏斗 5个，秒表 1个，冰箱 1台。1.3 药品桦木木聚糖，蛋白胨，马铃薯，蔗糖，木聚糖，麸皮，氯化钠，（NH4）2SO4，NH4CL，NH4NO3，NaNO3，KNO3，KH2PO

7、4，Mg SO4 ·7H2O，Tween80，牛肉膏，5°麦芽汁，尿素，蛋白胨，酵母膏，氯化钙，HCl，NaOH，3,5-二硝基水杨酸，苯酚，亚硫酸钠，酒石酸钾钠，葡萄糖，玉米芯和麸皮经粉碎后备用。1.4 试剂及配制方法DNS溶液的配制：称取3.15克DNS于131ml2摩尔/升NaOH溶液中（即NaOH 10.48克溶于131ml蒸馏水中），加入酒石酸钾钠的热溶液（91克酒石酸钾钠溶于250ml蒸馏水），再加2.5克苯酚和2.5克亚硫酸钠，溶解后冷却定容到500ml，贮于棕色瓶中3天后使用。1mg/mL葡萄糖标准液：准确秤取100mg分析纯葡萄糖（预先在80烘至恒重），置

8、于小烧杯中用少量的蒸馏水溶解后，定容转移到100mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱保存备用。2 方法2.1培养基种子培养基：马铃薯(去皮) 200g，蔗糖 20g，水 1000mL。将马铃薯去皮，切成约2cm3的小块，煮沸30min，再用双层纱布过滤 ，再补足水至 1000mL，pH自然，121高压灭菌20min。发酵培养基(%)：大麦粉4 玉米浆2 NaNO3 0.4 Na2HPO40.1 MgSO4.7H2O 0.03 FeSO4.7H2O 0.01 CaCO3 0.5 PH 6.7（消前）灭菌条件121，30min。 2.2产酶试验 将斜面培养基的菌种接一环孢子加入基础产酶培

9、养基，用250三角瓶装液50，旋转式恒温振荡器转速220r/min, 30培养48小时，按下面所述的方法测定木聚糖酶活。2.3 酶活测定方法取0.1ml适当稀释的粗酶液，加入0.1ml 2 %桦木木聚糖溶液（用0.2M的Hac-NaAc缓冲液配制，pH 4.6）,在50保温15分钟后，加入0.6ml DNS溶液，煮沸10分钟灭活显色，定容到5ml，在550nm波长下测定还原糖量（以木糖计），以灭活的酶液作为对照。酶活定义：在上述条件下，每分钟产生1微摩尔木糖所需要的酶量为一个酶活单位（IU/ml）。酶活E=1.53 D×Y 其中E木聚糖酶的活力，IU/ml，D酶液的稀释度，Y吸光值四

10、、实验设计每个做2个平行，每个平行做三个重复，测定木聚糖酶活力、发酵液pH，并观察发酵液的变化情况，记录之。1 菌种的产酶条件优化1.1碳源的影响单一碳源的影响 将基础产酶培养基中的麸皮换成不同碳源，其浓度为1%，进行产酶试验。单一碳源的影响碳源（%）木聚糖酶酶活力（IU/ml）碳源（%）木聚糖酶酶活力（IU/ml）燕麦木聚糖玉米芯桦木木聚糖葡萄糖麸皮蔗糖自制玉米芯半纤维素淀粉玉米芯的不同浓度对产酶的影响 将基础产酶培养基中的麸皮换成玉米芯，浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%进行试验。复合碳源对产酶的影响根据上次实验结果，以玉米芯为主碳源，另添加1%辅加碳源（燕麦木聚糖、

11、桦木木聚糖、自制玉米芯半纤维素、麸皮、葡萄糖等）进行试验，以不加辅加碳源的结果为100%。1.2氮源的影响1.2.1不同单一氮源的影响 在产酶基础培养基中，将蛋白胨分别换成不同的氮源。有机氮源含量为0.5%，无机氮源以氮元素含量0.2%计。氮源（%）木聚糖酶酶活力（IU/ml）氮源（%）木聚糖酶酶活力（IU/ml）（NH4）2SO4牛肉膏NH4CL酵母膏NH4NO3尿素NaNO3蛋白胨KNO3 NH4Cl的不同浓度对产酶的影响 将基础产酶培养基中的蛋白胨换成NH4Cl，浓度（以N含量计）分别为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%进行试验。1.2.3 复合氮源对产酶的影响 以最佳

12、氮源NH4Cl为基础，其中的50%分别换成其它几种氮源（NH4）2SO4、NH4NO3、NaNO3、KNO3、牛肉膏、酵母膏、尿素进行试验。氮源（%）木聚糖酶活力（IU/ml）氮源（%）木聚糖酶活力（IU/ml）NH4CL牛肉膏（NH4）2SO4酵母膏NH4NO3尿素KNO3蛋白胨NaNO31.3 培养基初始pH值的影响 分别以不同的pH值(1.0-12)进行产酶试验培养。1.4 磷源浓度的影响 在培养基中分别添加不同浓度的K2HPO4观察对产酶的影响，浓度从01.2%逐步增加。1.5 装液量的影响 在250ml三角瓶中分别装30ml、50 ml、80 ml、100 ml体积不等的基础产酶培养

13、基, 30，220rpm培养48小时后测木聚糖酶酶活力，观察对其产酶的影响。1.6金属离子的影响 先按实验要求配制合适浓度的Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe3+等金属离子，用薄膜过滤除菌法对配制好的各种金属离子溶液除菌，然后在无菌操作条件下将它们按要求加入灭菌的基本培养基中（终浓度为5mmol/l），接种培养后测其酶活力。1.7 吐温-80 对产酶的影响 在培养基中添加吐温-80，使其在培养基中的最终浓度分别0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%，不加吐温-80为100%，比较测得的酶活力。1.8 正交试验L9(34)根据前面单因子试验结

14、果，选取对木聚糖酶量增加幅度在50%以上的碳源 、氮源和金属离子进行3因子3水平正交试验（总含碳量按6%，总含氮量按0.8%）。选择最合适的培养基配方。2黑曲霉产木聚糖酶的产酶历程将菌种接入上述优化的培养基，30，220rpm条件下培养，分别在培养的不同时间：12小时、16小时、20小时、24小时、28小时、32小时、36小时、40小时、44小时、48小时、52小时时测木聚糖酶酶活，并绘制产酶曲线。五、作业1、根据各种单因素实验结果，确定产酶的最佳条件2、根据正交实验结果，分析产酶的最佳综合条件。3、绘制产酶曲线。教学手段和教学组织多媒体教学，启发式教学，传统讲授与演示系统介绍木聚糖结构以及降

15、解该糖的主要酶系强调菌种的特性重点讲述无菌操作介绍主要设备和仪器仔细介绍试剂配制的方法和注意事项演示酶活测定方法概述实验基本过程和各种原料的作用新乡医学院实验课教案首页课程名称：酶工程 授课教师姓名及职称：闫欣 助教一、授课题目实验二 木聚糖酶酶的分离与纯化二、授课对象2004级生物技术专业本科生三、实验教学目标与课时分配1 掌握离子交换层析的方法和原理2 掌握蛋白质含量测定和酶纯化程度测定的基本方法3 了解酶分离纯化的基本过程共12学时。四、授课重点蛋白质含量测定和酶纯化程度测定的基本方法五、授课难点掌握离子交换层析的方法和原理六、授课形式实验课教学，小班分组实验七、授课方法与课前准备讲授、

16、演示了解学生已学课程，及本学期所开课程及具体讲授内容，网上查阅相关资料八、教材与参考文献1.贾新成等。酶制剂工艺学，气象出版社。九、思考题根据实验过程，讨论酶分离纯化的基本过程十、教研室主任及课程负责人签字教研室主任（签字） 课程负责人（签字） 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案课程名称：酶工程 授课教师姓名及职称：闫欣 助教基本内容一、实验目的1 掌握离子交换层析的方法和原理2 掌握蛋白质含量测定和酶纯化程度测定的基本方法3 了解酶分离纯化的基本过程二、实验原理离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换剂是

17、含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。在溶液的pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离；当溶液pH值小于酶的等电点时，酶分子带正电荷，则要采用阳离子交换剂进行分离。按母体物质种类的不同，离子交换剂有离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。其中某些大孔径的离子交换树脂，离子交换纤维素和离子交换凝胶可用于酶的分离纯化。本实验所用的材料主要是DEAE-

18、Sepharose CL-6B。三、材料与方法1 材料1.1 菌种 黑曲霉1.2 仪器离心机，超滤器（VIVAFlow 200，滤膜为30000），层析柱(2.5cm×25cm)，部分收集器，梯度洗脱仪，紫外分光光度计，试管，透析袋。1.3 药品桦木木聚糖，Tris，醋酸，醋酸钠，HCl，NaOH1.4 试剂及配制方法DNS溶液的配制：称取3.15克DNS于131ml 2摩尔/升NaOH溶液中（即NaOH 10.48克溶于131ml蒸馏水中），加入酒石酸钾钠的热溶液（91克酒石酸钾钠溶于250ml蒸馏水），再加2.5克苯酚和2.5克亚硫酸钠，溶解后冷却定容到500ml，贮于棕色瓶中3

19、天后使用。反应中的缓冲液：0.02 mol/L, pH7.1的Tris-HCl缓冲液；0.02mol/L，pH5.5的醋酸缓冲液1.5蛋白质含量测定按照Lowry等人的方法,详细步骤参见汪家政蛋白质技术手册。2 方法和步骤2.1 DEAE-6B琼脂糖凝胶的预处理量取DEAE-6B琼脂糖约70ml，用pH7.1的Tris-HCl缓冲液反复漂洗，直至pH值达到7.1，真空抽滤除去气泡。2.2 装柱层析柱用洗涤液洗清洁，柱的下端联接塑料管，装上螺旋夹。关上螺旋夹，柱内装入缓冲液I，微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出，赶走死区及塑料管中的气泡，柱中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。 将基本平衡好的DEAE-Sep

20、harose 6B浆液沿管壁倒人柱中，待沉降至床高约1cm高度时，部分旋松螺旋夹，让溶液缓慢流出去，注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢，陆续加入较多的浆液，直至达到高10cm以上的柱床体积。AB图 梯度洗脱装置示意图2.3 平衡当全部交换剂装入柱中后，用上柱起始缓冲液进行平衡。流速可维持在4mL/15min，直至流出液的pH与上柱缓冲液完全相同。（一般要平衡8h以上或过夜。）2.4超滤将发酵液用四层纱布过滤，然后10000r/min离心15min，取上清即为粗酶液。用VIVAFlow 200的超滤器对粗酶液进行超滤。2.5 DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换柱层析将滤过液用0

21、.02M, pH7.1的Tris-HCl缓冲液充分稀释之后，上DEAE-Sepharose CL-6B柱(2.6cm×20cm)。用pH7.1，0.02 M Tris-HCl缓冲液配制的00.5M NaCl（各300ml）进行线性梯度洗脱，流速0.4ml/min，5ml收集1管。测定其A280吸光度。2.6 DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换柱再层析将上步收集的酶液用0.02mol/L，pH5.5的醋酸缓冲液充分稀释之后，再次上经pH5.5醋酸缓冲液预平衡的DEAE-SepharoseCL-6B柱。用pH5.5，0.02M Tris-HCl 缓冲液配制的00.5mol

22、/lNaCl（各300ml）进行线性梯度洗脱，流速0.4ml/min，分步收集，每管5ml。测定洗脱液A280，并对洗脱液进行SDS-PAGE。2.7 SDS-PAGE方案参照附表四 结果与计算1 画出层析图谱并标出酶活曲线和线性梯度曲线。2 计算蛋白回收率、酶活回收率、纯化倍数。3 求出酶活最高峰时洗脱液盐的浓度。教学手段和教学组织多媒体教学，启发式教学，传统讲授与演示系统介绍离子交换层次的材料和原理详细介绍仪器的主要使用方法强调一下蛋白质浓度测定的含义和方法详细介绍材料的前处理方法和过程强调装柱过程中不能有气泡存在注意平衡的重要性尽量加酶液，直至吸附满为止介绍蛋白质电泳方法新乡医学院实验课

23、教案首页课程名称：酶工程 授课教师姓名及职称：高启禹 讲师一、授课题目实验三 木聚糖酶的酶学性质测定二、授课对象2004级生物技术专业本科生三、实验教学目标与课时分配1. 掌握木聚糖酶性质的测定方法2. 测定并了解黑曲霉木聚糖酶的酶学性质共12学时。四、授课重点木聚糖酶性质的测定方法五、授课难点木聚糖酶性质的测定六、授课形式实验课教学，小班分组实验七、授课方法与课前准备讲授、演示了解学生已学课程，及本学期所开课程及具体讲授内容，网上查阅相关资料八、教材与参考文献1.贾新成等。酶制剂工艺学，气象出版社。九、思考题1、根据实验结果，确定木聚糖酶的最佳作用条件。2、根据实验结果，分析木聚糖酶的酶学性

24、质，并同其他木聚糖酶进行比较。十、教研室主任及课程负责人签字教研室主任（签字） 课程负责人（签字） 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案课程名称：酶工程 授课教师姓名及职称：高启禹 讲师基本内容一、实验目的1. 掌握木聚糖酶性质的测定方法2. 测定并了解黑曲霉木聚糖酶的酶学性质二、实验原理木聚糖酶在自然界分布很广，在海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌、酵母、瘤胃和细菌、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在木聚糖酶。目前对木聚糖酶性质的研究主要集中在细菌和真菌上，而这些木聚糖酶的性质也因来源不同有很大区别。大多数微生物来源的木聚糖酶具有以下基本性质：单亚基蛋白，分子量范围81

25、45kDa，等电点pI为310；酶的最适作用pH值为4.07.0，pH稳定范围3.010.0；木聚糖酶的热稳定性较好，一般都在40以上，完全失活温度在65以上。 关于木聚糖酶的酶学性质的测定方法，主要是通过在不同的温度、pH、金属粒子等条件下，研究酶的最适作用条件以及稳定性，掌握该酶的酶学性质，从而确定酶的应用范围。三、材料与方法1 材料1.1 菌种 黑曲霉1.2 仪器水浴锅，超净工作台 1台，接种环 2支，酒精灯 1盏，三角瓶（250mL） 60个，搪瓷缸（1000mL） 1个，纱布，棉塞（若干），25 mL容量瓶20个，50 mL容量瓶20个，振荡培养箱 1台，25mL试管若干，分光光度计

26、1台，离心机1台，离心管（10mL）10个，胶头滴管 10支，精密酸度计 1台，天平（精确0.0001g和0.01g） 各一台，记号笔 1支，水浴锅 1个，高压灭菌锅 1台，电炉 1个，烧杯50mL、100mL、200mL 各10个，漏斗 5个，秒表 1个，冰箱 1台。1.3 药品桦木木聚糖，蛋白胨，马铃薯，蔗糖，木聚糖，麸皮，氯化钠，（NH4）2SO4，NH4CL，NH4NO3，NaNO3，KNO3，KH2PO4，Mg SO4 ·7H2O，Tween80，牛肉膏，5°麦芽汁，尿素，蛋白胨，酵母膏，氯化钙，HCl，NaOH，3,5-二硝基水杨酸，苯酚，亚硫酸钠，酒石酸钾钠，

27、葡萄糖，玉米芯和麸皮经粉碎后备用。1.4 试剂及配制方法DNS溶液的配制：称取3.15克DNS于131ml2摩尔/升NaOH溶液中（即NaOH 10.48克溶于131ml蒸馏水中），加入酒石酸钾钠的热溶液（91克酒石酸钾钠溶于250ml蒸馏水），再加2.5克苯酚和2.5克亚硫酸钠，溶解后冷却定容到500ml，贮于棕色瓶中3天后使用。反应中的缓冲液：pH4.6的0.2M的醋酸缓冲液，的0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液，的0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠，的0.1M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。2 方法2.1培养基种子培养基：马铃薯(去皮) 200g，蔗糖 20g，水 1000mL。将马铃薯去皮，切成约2cm3的小

28、块，煮沸30min，再用双层纱布过滤 ，再补足水至 1000mL，pH自然，121高压灭菌20min。发酵培养基(%)：大麦粉4，玉米浆2，NaNO3 0.4，Na2HPO40.1，MgSO4.7H2O 0.03，FeSO4.7H2O 0.01，CaCO3 0.5，PH 6.7（消前），灭菌条件121，30min。 2.2粗酶液的制备将培养后的发酵液四层纱布过滤，10000rpm离心10分钟，上清即为粗酶液。2.3酶活力测定方法木聚糖酶活力：取0.1ml适当稀释酶液, 0.1ml 2%桦木木聚糖，加入到0.8ml的醋酸钠缓冲液中(0.2M、pH4.6)，50水浴反应15min，加入0.6 ml

29、 DNS试剂终止反应，沸水浴煮沸15分钟，定容到5ml，550nm波长下测定吸光度(以木糖计）。以每分钟产生1mol木糖作为1个酶活力单位(U)。四、实验设计1 pH值对酶活力的影响pH值对纯酶活力的影响：用pH1.62.6的0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液、pH3.67.6的0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠和pH8.610.6的0.1M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液代替常规测活方法中的pH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液进行酶活力测定。2 pH稳定性试验将酶液加到不同pH值的缓冲液中（pH1.610.6）于30保温24小时，适当稀释后按照常规方法测定酶活力。3 温度对酶活力的影响将酶液在2090下按照常规方法测定酶活

30、力。4 温度稳定性实验将酶液在2080水浴保温1h，取出放入冰浴中，按照常规方法测定酶活力。5 金属离子对酶活力的影响各种金属离子（Ca2+，Co2+，Fe2+，Cu2+，Mn2+，Pb2+，Mg2+，Hg2+，K+，Zn2+，EDTA，反应体系中各种金属离子的终浓度为1mM）与酶液在50保温30分钟，然后按常规方法测定酶活力。五、作业1、根据实验结果，确定木聚糖酶的最佳作用条件。2、根据实验结果，分析木聚糖酶的酶学性质，并同其他木聚糖酶进行比较。教学手段和教学组织多媒体教学，启发式教学，传统讲授与演示系统介绍木聚糖酶的存在方式和主要特性强调玻璃仪器的清洁性，并仔细介绍试剂配制的方法和注意事项

31、注意离心要在低温下进行演示酶活测定方法注意缓冲溶液的缓冲极限强调保温时间强调保温时间新乡医学院实验课教案首页课程名称：酶工程 授课教师姓名及职称：高启禹 讲师一、授课题目实验四 木聚糖酶的固定化二、授课对象2004级生物技术专业本科生三、实验教学目标与课时分配1 掌握酶的固定化的方法和原理2 掌握固定化酶酶学性质的研究方法共12学时。四、授课重点酶的固定化方法和固定化酶酶学性质五、授课难点酶的固定化六、授课形式实验课教学，小班分组实验七、授课方法与课前准备讲授、演示了解学生已学课程，及本学期所开课程及具体讲授内容，网上查阅相关资料八、教材与参考文献1.贾新成等。酶制剂工艺学，气象出版社。九、思

32、考题讨论固定化酶的优点及缺点。十、教研室主任及课程负责人签字教研室主任（签字） 课程负责人（签字） 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案课程名称：酶工程 授课教师姓名及职称：高启禹 讲师基本内容一、实验目的1 掌握酶的固定化的方法和原理2 掌握固定化酶酶学性质的研究方法二、实验原理酶的固定化是指用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶

33、，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。酶的催化反应依赖于它的活性部位的完整性，因此在固定某一酶时必须选择适当条件，使其活性部位的基团不受影响，并避免高温、强酸及强碱等条件，并保持蛋白质的活性。酶的固定化方法简述于下： 载体结合法 最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。此法曾先后用于3-核糖核酸酶、5-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。交联法 依靠

34、双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。包埋法 酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍（如5-磷酸二酯酶的工业应用）甚至几百倍（如青霉素酰化酶的工业应用）