第一章分离与纯化

1、分离纯化工艺原理分离纯化工艺原理讲 授：谭朝阳邮箱：第一章分离与纯化概论第一章分离与纯化概论第一节分离纯化技术在生物制药中第一节分离纯化技术在生物制药中的地位的地位如何获取某种生物药物的产品？如何获取某种生物药物的产品？基因工程、蛋白质工程基因工程、蛋白质工程菌种构建菌种构建上游上游微生物发酵工程微生物发酵工程酶工程酶工程产物积累产物积累中游中游动植物细胞培养工程动植物细胞培养工程分离工程分离工程产物纯化产物纯化下游下游生物技术下游加工过程生物技术下游加工过程 Downstream Processingl下游加工过程：从发酵液、酶反应液、或动植下游加工过程：从发酵液、酶反应液、或动植物细胞培养

2、液中分离、纯化生物产品的过程。物细胞培养液中分离、纯化生物产品的过程。l分离纯化方法复杂，技术要求高，成本昂贵分离纯化方法复杂，技术要求高，成本昂贵l下游加过程的成本：下游加过程的成本：氨基酸：下游投资为发酵部分的氨基酸：下游投资为发酵部分的1.51.5倍倍抗生素：下游投资为发酵部分的抗生素：下游投资为发酵部分的4 4倍倍基因工程药物（如重组蛋白质）：占整个生产基因工程药物（如重组蛋白质）：占整个生产费用的费用的80%-90%80%-90%第二节生物技术下游加工过程的特点第二节生物技术下游加工过程的特点一、发酵液（培养液）是复杂的多相体系，含固一、发酵液（培养液）是复杂的多相体系，含固体、液体

3、、气体、胶状物质等，多组分的混合体、液体、气体、胶状物质等，多组分的混合物物 。l细胞：蛋白质、核酸、多糖、脂类等细胞：蛋白质、核酸、多糖、脂类等l代谢产物：目标产物、中间产物、前体代谢产物：目标产物、中间产物、前体l未用完的培养基未用完的培养基l预处理的添加物预处理的添加物 组分复杂组分复杂(a (a 大分子大分子;b ;b 小分子小分子;c ;c 可溶物可溶物;d ;d 不可溶不可溶物物;e ;e 化学添加物化学添加物二、产物浓度很低二、产物浓度很低几种典型产品发酵液的浓度几种典型产品发酵液的浓度典型产品发酵液浓度（g/L)抗生素氨基酸维生素多糖酶蛋白质25100252102010(原因：

4、原因：a 氧传递限制；氧传递限制；b 细胞量细胞量;c 产物抑制产物抑制三、产物的稳定性差三、产物的稳定性差（1 1）化学降解：温度、）化学降解：温度、pHpH值、有机溶剂值、有机溶剂蛋白质：辅助因子、空间构型蛋白质：辅助因子、空间构型手性分子：外消旋手性分子：外消旋（2 2）微生物降解：细胞中存在降解酶）微生物降解：细胞中存在降解酶容易腐败、染菌、被微生物的活动分解或自身的酶所容易腐败、染菌、被微生物的活动分解或自身的酶所破坏，机械搅拌、空气、日光等对生物物质的活性都破坏，机械搅拌、空气、日光等对生物物质的活性都会发生影响。会发生影响。措施：低温、快速操作（时间短），措施：低温、快速操作（时

5、间短），pHpH适中、勤洗消适中、勤洗消毒（防止染菌污染）等毒（防止染菌污染）等四、四、分批操作，生物变异性大分批操作，生物变异性大l生物材料组分数量大，分离困难生物材料组分数量大，分离困难l目标产物与杂质的理化性质如溶解度、相对分目标产物与杂质的理化性质如溶解度、相对分子量、等电点都十分相近，分离与纯化比较困子量、等电点都十分相近，分离与纯化比较困难难五、终产品的质量要求很高五、终产品的质量要求很高l青霉素：青霉噻唑蛋白青霉素：青霉噻唑蛋白RIA值（放射免疫分析值（放射免疫分析值）值）100（相当于（相当于1.5106）l蛋白质药物：杂蛋白蛋白质药物：杂蛋白2%l重组胰岛素：杂蛋白重组胰岛素

6、：杂蛋白0.01%收率低、成本高收率低、成本高l稳定性差，收率低，损失大稳定性差，收率低，损失大l分离纯化方法复杂、昂贵分离纯化方法复杂、昂贵l下游加过程的成本：下游加过程的成本：氨基酸：下游投资为发酵部分的氨基酸：下游投资为发酵部分的1.51.5倍倍抗生素：下游投资为发酵部分的抗生素：下游投资为发酵部分的4 4倍倍基因工程药物（如重组蛋白质）：占整个生产基因工程药物（如重组蛋白质）：占整个生产费用的费用的80%80%90%90%生物技术下游加工过程特点生物技术下游加工过程特点第三节传统生物产品的分离纯化方法第三节传统生物产品的分离纯化方法l分离纯化可分四个阶段：1 1、发酵液的预处理和固液分

7、离、发酵液的预处理和固液分离2 2、初步分离（提取）、初步分离（提取）3 3、高度纯化（精制）、高度纯化（精制）4 4、成品加工、成品加工 细胞回收细胞回收技术技术: 絮凝，离心，过滤，微过滤。絮凝，离心，过滤，微过滤。 细胞破碎细胞破碎技术技术: 球磨，高压匀浆，化学破碎技术球磨，高压匀浆，化学破碎技术 初步纯化初步纯化技术技术: 吸附剂，离子交换，沉淀（盐析吸附剂，离子交换，沉淀（盐析 法，有机溶剂沉淀，等电点，沉淀剂），溶剂萃法，有机溶剂沉淀，等电点，沉淀剂），溶剂萃 取，两水相萃取，超临界萃取，逆胶束萃取，膜取，两水相萃取，超临界萃取，逆胶束萃取，膜 分离技术分离技术 高度纯化高度纯化

8、技术技术: 各类层析，亲和，疏水，聚焦，离各类层析，亲和，疏水，聚焦，离 子交换，结晶子交换，结晶 成品加工成品加工：浓缩，除菌与热原，喷雾干燥，气流干：浓缩，除菌与热原，喷雾干燥，气流干 燥，沸腾干燥，冷冻燥燥，沸腾干燥，冷冻燥分离纯化的一般工艺流程分离纯化的一般工艺流程单元操作单元操作1 1、发酵液的预处理和固液分离、发酵液的预处理和固液分离发酵液预处理的目的在于改变发酵液的性质，以利于发酵液预处理的目的在于改变发酵液的性质，以利于固液分离。固液分离。 降低发酵液的黏度：酸化、加热等降低发酵液的黏度：酸化、加热等凝聚和絮凝技术：聚结成较大颗粒，加速固液分离凝聚和絮凝技术：聚结成较大颗粒，加

9、速固液分离固液分离固液分离固液分离基本的单元操作：过滤和离心固液分离基本的单元操作：过滤和离心错流膜过滤技术：减少过滤介质阻力错流膜过滤技术：减少过滤介质阻力l板框压滤机板框压滤机l鼓式真空过滤机：较粗的真菌菌丝体鼓式真空过滤机：较粗的真菌菌丝体l倾析式离心机：含固体量较多的发酵液倾析式离心机：含固体量较多的发酵液细胞破碎和碎片分离细胞破碎和碎片分离如产物在细胞内，还要进行细胞破碎如产物在细胞内，还要进行细胞破碎高压匀浆器高压匀浆器：利用液相剪切力与固定表面撞击：利用液相剪切力与固定表面撞击所产生的力。所产生的力。高速球磨机高速球磨机：研磨：研磨实验室还可用化学、酶解、干燥等方法实验室还可用化

10、学、酶解、干燥等方法碎片分离：离心、双水相萃取碎片分离：离心、双水相萃取单元操作单元操作2 2、初步分离（提取）：、初步分离（提取）：除去与产物性质差异大除去与产物性质差异大的杂质，使产物浓度和质量提高。的杂质，使产物浓度和质量提高。可选范围广：吸附、萃取、沉淀等可选范围广：吸附、萃取、沉淀等3 3、高度纯化（精制）：、高度纯化（精制）：与（与（2 2）类似）类似层析、电泳等层析、电泳等4 4、成品加工：、成品加工：浓缩、结晶、干燥等浓缩、结晶、干燥等溶剂萃取法溶剂萃取法l目标产物不同的化学状态存在时，在水中及与目标产物不同的化学状态存在时，在水中及与水不互溶的溶剂中有不同的溶解度。水不互溶的

11、溶剂中有不同的溶解度。l青霉素在酸性下成游离酸，在醋酸丁酯中溶解度较大，青霉素在酸性下成游离酸，在醋酸丁酯中溶解度较大，使之从发酵液中转移到醋酸丁酯相中。使之从发酵液中转移到醋酸丁酯相中。在中性成盐的条件下，在水中溶解度大，再从醋酸丁在中性成盐的条件下，在水中溶解度大，再从醋酸丁酯中转移至水相。酯中转移至水相。离子交换分离法离子交换分离法l利用离子交换树脂和目标产物之间的化学亲和利用离子交换树脂和目标产物之间的化学亲和力（电荷），有选择性地将产物吸附上去，然力（电荷），有选择性地将产物吸附上去，然后改变条件将其洗脱下来，以达到浓缩和提纯后改变条件将其洗脱下来，以达到浓缩和提纯目的。目的。吸附分

12、离法吸附分离法l利用吸附剂与产物之间的分子引力将产物吸附利用吸附剂与产物之间的分子引力将产物吸附在吸附剂上，再选用洗脱剂将其洗脱下来。在吸附剂上，再选用洗脱剂将其洗脱下来。l活性炭、硅胶、氧化铝、大孔吸附树脂活性炭、硅胶、氧化铝、大孔吸附树脂l选择性较差、可逆性较差、劳动强度大选择性较差、可逆性较差、劳动强度大沉淀分离法沉淀分离法l加入一些无机或有机离子或整个分子，能与目加入一些无机或有机离子或整个分子，能与目标产物形成不溶解的盐或复合物而自发酵液中标产物形成不溶解的盐或复合物而自发酵液中沉淀出来。沉淀出来。l发酵单位越高，利用沉淀分离法越有利，因为发酵单位越高，利用沉淀分离法越有利，因为收率

13、越高（溶液中的残留量是一定的）收率越高（溶液中的残留量是一定的）化学萃取法化学萃取法l在液液萃取过程中常伴有化学反应，包括相在液液萃取过程中常伴有化学反应，包括相内反应与相界面上的反应。内反应与相界面上的反应。络合反应络合反应阳离子交换反应阳离子交换反应离子缔合反应离子缔合反应协同反应协同反应带同萃取反应带同萃取反应超临界流体萃取法超临界流体萃取法l在较高压力下，液相与气相的物理性质（如密在较高压力下，液相与气相的物理性质（如密度、黏度等）差别逐渐缩小，到某一点时（临度、黏度等）差别逐渐缩小，到某一点时（临界点）消失，合并为一相，称为界点）消失，合并为一相，称为超临界流体超临界流体。l超临界流

14、体：密度大（同液体），扩散速度快超临界流体：密度大（同液体），扩散速度快（同气体），萃取能力强。（同气体），萃取能力强。l常用常用二氧化碳二氧化碳作为萃取剂。作为萃取剂。l夹带剂（极性溶剂）改善对极性物质的萃取能夹带剂（极性溶剂）改善对极性物质的萃取能力。力。膜分离法膜分离法l利用一定截留分子量的超滤膜进行溶质的分离利用一定截留分子量的超滤膜进行溶质的分离或浓缩。小于截留值的分子通过膜，大于截留或浓缩。小于截留值的分子通过膜，大于截留值的分子不能通过膜。值的分子不能通过膜。l能耗少，无污染。能耗少，无污染。l缺点：浓差极化、膜的污染、寿命较短、通量缺点：浓差极化、膜的污染、寿命较短、通量低。低

15、。第四节现代生物药物的分离纯化第四节现代生物药物的分离纯化 l基因工程药物：多数通过基因工程药物：多数通过重组微生物重组微生物得到。得到。l动物细胞培养动物细胞培养：单克隆抗体、疫苗、激素、免：单克隆抗体、疫苗、激素、免疫调节剂等疫调节剂等l特点：特点：（1 1）有效成分含量低：有效成分含量低：5 550ug/ml50ug/ml（2 2）产品纯度要求很高）产品纯度要求很高: :杂蛋白杂蛋白100ppm100ppm传统生物产品与基因工程产品回收方法的比较传统生物产品与基因工程产品回收方法的比较l传统产品传统产品 l(1) (1) 小分子（少数工业用粗酶）小分子（少数工业用粗酶）l(2) (2)

16、理化性质清楚理化性质清楚l(3) (3) 易于放大易于放大l基因产品基因产品l(1) (1) 大分子大分子l(2) (2) 胞内胞内l(3) (3) 不稳定不稳定l(4) (4) 放大困难放大困难一、初步分离方法一、初步分离方法 l胞内产物：细胞破碎胞内产物：细胞破碎去核酸：聚乙烯亚胺沉淀去核酸：聚乙烯亚胺沉淀蛋白质形成不溶解的包含体，先变性，再折叠蛋白质形成不溶解的包含体，先变性，再折叠成天然形式成天然形式l动物细胞培养：分泌在培养液中，不要破碎细动物细胞培养：分泌在培养液中，不要破碎细胞，但浓度很稀，要浓缩。可采用膜浓缩或硫胞，但浓度很稀，要浓缩。可采用膜浓缩或硫酸铵沉淀法浓缩。酸铵沉淀法

17、浓缩。（一）沉淀分离法（一）沉淀分离法 （1 1）盐析：高浓度盐破坏蛋白质分子水化层，）盐析：高浓度盐破坏蛋白质分子水化层，使蛋白质沉淀。使蛋白质沉淀。（2 2）加入有机溶剂：降低溶液的介电常数，使）加入有机溶剂：降低溶液的介电常数，使水分子溶解能力降低。水分子溶解能力降低。（3 3）调）调pHpH至等电点：沉淀能力不强，可同时加至等电点：沉淀能力不强，可同时加入有机溶剂入有机溶剂（4 4）加入非离子型聚合物：如聚乙二醇（）加入非离子型聚合物：如聚乙二醇（PEGPEG）（5 5）加入聚电解质：如聚丙烯酸）加入聚电解质：如聚丙烯酸（二）双水相萃取（二）双水相萃取l仅适用于蛋白质的分离。仅适用于蛋

18、白质的分离。l聚合物分子的不相容性，两种聚合物的水溶液聚合物分子的不相容性，两种聚合物的水溶液可分为两相。可分为两相。l如如PEGPEG与葡聚糖的水溶液与葡聚糖的水溶液二、高度纯化方法二、高度纯化方法（一）色谱法：适合分离大分子物质（一）色谱法：适合分离大分子物质色谱柱中形成固定相和移动相，物质在两相间分配情况色谱柱中形成固定相和移动相，物质在两相间分配情况不同，使得在柱中的运动速度不同而分离。不同，使得在柱中的运动速度不同而分离。方法机制分离能力容量离子交换层析吸附层析聚焦层析疏水层析亲和层析金属螯合层析电荷和离解度范德华力、氢键等电点表面自由能特殊的生物作用力金属螯合很高高很高高优异高很大

19、小大大很大大（二）结晶和重结晶（二）结晶和重结晶l适用于小分子物质适用于小分子物质l先决条件是：溶液达到过饱和先决条件是：溶液达到过饱和l可采用的方法：冷却、蒸发、加入反应剂、等可采用的方法：冷却、蒸发、加入反应剂、等电点、盐析、共沸蒸馏电点、盐析、共沸蒸馏三、成品加工三、成品加工（一）浓缩（一）浓缩薄膜蒸发（薄膜蒸发（1min1min）离心薄膜蒸发器（离心薄膜蒸发器（1 110s10s）：适用热敏性物质）：适用热敏性物质（二）无菌过滤和去热原：（二）无菌过滤和去热原：超滤（对小分子物质）超滤（对小分子物质）阴离子交换（对大分子蛋白质）阴离子交换（对大分子蛋白质）（三）干燥（三）干燥对热敏物质

20、（喷雾干燥和冷冻干燥）对热敏物质（喷雾干燥和冷冻干燥）非蛋白类杂质的去除非蛋白类杂质的去除（1 1） DNA DNA A A 阴离子交换（阴离子交换（pH 4.0)pH 4.0) B B 亲和层析（不被吸附）亲和层析（不被吸附） C C 疏水层析疏水层析（2 2）热原热原 （蛋白质溶液中的去热原）（蛋白质溶液中的去热原） A A 生产过程无菌生产过程无菌 B B 所有层析介质无菌所有层析介质无菌 C C 所用溶液无菌所用溶液无菌 D D 亲和层析（多粘菌素）亲和层析（多粘菌素）（3 3）去病毒去病毒 A A 加热加热 （60 C)60 C) B B 过滤过滤 C C 灭活剂灭活剂第五节下游加工

21、过程的选择准则第五节下游加工过程的选择准则高产率、低成本高产率、低成本一、步骤尽量少一、步骤尽量少每步回收率每步回收率90%90%，共六步，则总收率只有，共六步，则总收率只有0.90.96 654%54%。基因工程蛋白质能达到基因工程蛋白质能达到303040%40%就很好了就很好了二、采用步骤的次序要相对合理二、采用步骤的次序要相对合理l沉淀：能大量处理物质，且受干扰影响小，放在工艺流程前段。l离子交换：除去对后续分离产生影响的化合物l亲和技术：常在流程后阶段，以避免因非专一作用引起亲和系统性能降低。l凝胶过滤：容量较小，处理量少，最后一道处理中，进行脱盐等三、其他考虑因素三、其他考虑因素（1

22、 1）产品的规格：诊断用、口服药、注射药等）产品的规格：诊断用、口服药、注射药等（2 2）生产规模：决定所采用的方法，或增加多）生产规模：决定所采用的方法，或增加多台设备台设备（3 3）进料组成：胞内、胞外、可溶性、发酵液）进料组成：胞内、胞外、可溶性、发酵液的浓度、黏度等的浓度、黏度等（4 4）产品的形式：溶液、粉末、晶体形态）产品的形式：溶液、粉末、晶体形态（5 5）产品的稳定性）产品的稳定性（6 6）物理性质：溶解度、分子电荷、分子大小、）物理性质：溶解度、分子电荷、分子大小、功能团、稳定性、挥发性功能团、稳定性、挥发性目标成分与杂质之间的理化性质差异越大，其分离效目标成分与杂质之间的理

23、化性质差异越大，其分离效果越好。果越好。（7 7）危害性：有机溶剂、重组）危害性：有机溶剂、重组DNADNA工程菌菌体的工程菌菌体的处理、处理用的化学品处理、处理用的化学品（8 8）废水：）废水：（9 9）分批或连续操作）分批或连续操作分离纯化的目的以最简单有效的技术，以最简单有效的技术， 最少的步骤，最少的步骤， 最高的收率，最高的收率， 最低的成本，最低的成本， 生产合格产物。生产合格产物。分离纯化方法的选择依据分离纯化方法的选择依据一、生物药物的理化性质一、生物药物的理化性质极性还是非极性，极性化合物进一步确定其酸性、碱极性还是非极性，极性化合物进一步确定其酸性、碱性或两性，以及酸碱性的

24、强弱。在各种溶剂中的溶解性或两性，以及酸碱性的强弱。在各种溶剂中的溶解度，度，pHpH、温度、其他盐类对其溶解度的影响等。、温度、其他盐类对其溶解度的影响等。二、生物药物的稳定性二、生物药物的稳定性合适的合适的pHpH和温度范围和温度范围三、极性和溶解度三、极性和溶解度新药物的极性确定：纸层析法和纸电泳法新药物的极性确定：纸层析法和纸电泳法纸层析法纸层析法l滤纸为载体，吸附的水分是固定相，另一溶剂滤纸为载体，吸附的水分是固定相，另一溶剂为移动相，使物质在两相间不断分配。为移动相，使物质在两相间不断分配。l极性物质在极性强的溶剂中极性物质在极性强的溶剂中RfRf值较大值较大l非极性物质在非极性溶

25、剂中非极性物质在非极性溶剂中RfRf值较大值较大l利用八种溶剂系统的纸层析数据决定物质的利用八种溶剂系统的纸层析数据决定物质的极极性和溶解性性和溶解性。lpH-pH-纸层析法研究物质的离解性能。纸层析法研究物质的离解性能。纸电泳法纸电泳法l判断物质的电离性质。判断物质的电离性质。l不同的物质由于带电性质、电荷数量以及分子不同的物质由于带电性质、电荷数量以及分子量大小不同，在一定时间内在电场作用下，移量大小不同，在一定时间内在电场作用下，移动的方向和距离是不同的。动的方向和距离是不同的。l碱性物质：带正电荷，电泳时移向负极碱性物质：带正电荷，电泳时移向负极l酸性物质：带负电荷，电泳时移向正极酸性物质：带负电荷，电泳时移向正极l中性物质：电泳时不移动中性物质：电泳时不移动l两性物质：移动方