发酵过程及优化实验⒊⒏

1、发酵过程及优化实验产淀粉酶细菌的优化实验班级：08生工1 姓名：顾婷婷 学号：060508138一、实验目的1.温故配制微生物培养基的原理及配制的一般方法、操作步骤；了解鉴别性培养基的原理，并掌握配制鉴别性培养基的放到和步骤。2.了解分批培养时微生物生长曲线形成的原理及各时期的主要特点。学习微生物生长曲线和产物形成曲线的测定方法。3.掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法，掌握在微生物分批培养时酶活力测定的基本方法。4.了解发酵条件对产物形成的影响，用单因子试验找出实验菌株的最佳培养条件。5.掌握发酵培养基的配制原则，熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。二、实验原理鉴别性培养基是一

2、类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。如对于淀粉酶产生菌的筛选，选用的是在含有淀粉的培养基中培养微生物，滴加碘液进行染色，若出现透明圈，则表明该菌能产生胞外淀粉酶。将少量微生物接种到一定体积的新鲜培养基中，在适宜的条件下培养，定时测定培养液中微生物的生长量（吸光度或活菌数的对数），以生长量为纵坐标，培养时间为横坐标绘制的曲线就是生长曲线，它反映了微生物在一定环境条件下的群体生长规律。依据生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。这四个时期的长短因菌种的遗传特性、接种量

3、和培养条件而异。因此，通过微生物生长曲线的测定，可了解微生物的生长规律，对于科研和生产实践都具有重要的指导意义。本实验采用比浊法来测定。由于菌悬液的浓度与吸光值（A）也称光密度成正比，只要用分光光度计测得菌液的A后与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌株的生长曲线。产物形成曲线就是产物产量对培养时间的曲线。学会生长曲线和产物形成曲线的测定对工业发酵具有非常重要的指导意义。淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失 ，因此可以根据一定时

4、间内蓝色消失的程度为指标来测定-淀粉酶的活力。发酵培养基是指大生产时所用的培养基，由于发酵产物中一般含有较高比例的碳元素，因此培养基中的碳源含量也应该比种子培养基中高。培养基组分对发酵起着关键性的影响作用。发酵培养基中的原料多是大分子物质，微生物一般不能直接吸收，必须通过胞外酶的作用后才能被利用，所以是一些“迟效性”营养物质。而微生物分泌的胞外酶有不少是诱导酶，为了使发酵起始阶段微生物能快速繁殖，可适当在培养基中添加一些速效营养物。三材料与器材1 菌种 枯草芽孢杆菌2. 培养基普通培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，自来水1000mL，pH7.27.4。鉴别型培养基：牛肉膏3g，

5、蛋白胨10g，可溶性淀粉10g， NaCl 5g，琼脂20g，自来水1000mL，pH7.27.4。3. 器皿：电子天平，烧杯，锥形瓶，量筒，培养皿，玻棒，涂布棒，移液管，pH试纸，棕色瓶，容量瓶，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，分光光度计，摇床，恒温水浴锅等。4.药品：牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，蒸馏水，可溶性淀粉，琼脂，NaOH, 碘化钾，碘，十二水合磷酸氢二钠，柠檬酸，乙酸，葡糖糖，果糖，蔗糖，乳糖。5.试剂（1） 碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500mL，贮于棕色瓶中。（2） 比色稀细碘液：取碘原液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500mL，贮于棕

6、色瓶中。（3） 2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀，倒入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100mL。须当天配制。（4） pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）4.523g，柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至100mL。（5） 0.5mL/L乙酸溶液，0.85%生理盐水。6.其他：药匙，记号笔，报纸等。四、方法和步骤（一）培养基的配置、灭菌1. 配制基本培养基1500ml , 分装50mL至250mL锥形瓶，共23瓶，供实验菌株扩增。2配制鉴别培养基（可溶性淀粉10g/L和15g/L两种）各1

7、00ml，检测实验菌株是否能产胞外淀粉酶。3配制稀释用的生理盐水，分装4.5mL至每个试管。3包扎培养皿、锥形瓶，移液管等。4121，灭菌20min。（二）生长曲线的测定1. 将实验菌株经过适当稀释涂布在鉴别性培养基上培养2天，在菌落周围滴加碘液，根据透明圈的大小，挑取合适的单菌落进行后续实验。2. 将选择的菌挑取到新鲜的基本培养基中，放置摇床上30，180rpm培养，过夜。3. 将第2步中培养得到的菌悬液摇匀，吸取0.5mL接入新鲜基本培养集中，30，180rpm培养，每隔4h取一瓶，在560nm处测吸光度，以未接种、但已灭菌的基本培养基作对照；每隔2小时取次样。4. 以培养时间为横坐标，吸

8、光值为纵坐标，作生长曲线。（三）产物形成曲线的测定同上，在进行生长量测定的同时，进行产物形成量（淀粉酶活力）的测定，以培养实验为横坐标，产物形成量为纵坐标，作出产物形成曲线。（四）液化型淀粉酶活力的测定1 标准曲线的制作（1） 将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%，1.5%和2%的稀释液。（2） 吸取淀粉稀释液2.0mL加至试管中，再加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.0mL，40水浴保温5min。（3） 加蒸馏水1mL，40保温30min后加入0.5mol/L乙酸10mL。（4） 吸取反应液1mL，加稀碘液10mL，混匀，在660nm下测得吸光度A（用2.0mL蒸馏水代替步骤（2）中的淀粉

9、稀释液作为对照）。（5） 以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。2 淀粉酶活力测定用2%可溶性淀粉按1（2）操作，用稀释后的粗酶液1mL代替1（3）中的蒸馏水，测得吸光度A660，从标准曲线中查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量。管号12345678910淀粉稀释液/mL2222222222缓冲液/mL111111111140水浴锅保温5min蒸馏水/mL1111111111粗酶液/mL111111111140保温30min，然后加入0.5mol/L乙酸10mL，混匀吸取反应液1mL稀碘液/mL10101010101010101010A6603酶活力计算 酶活力以每毫升粗酶液在4

10、0，pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。（五）实验菌株的培养基条件的优化1. 将实验菌株接种至新鲜的基本培养基中，30C培养过夜。2. 配制新鲜的基本培养基750ml，分5份每份150ml，分别加入葡萄糖（20g/L）、可溶性淀粉（18g/L）、果糖（20g/L）、蔗糖（18g/L）和乳糖（20g/L）。121C,20min,高压蒸汽灭菌。3. 取上述菌悬液0.5ml接种至各个培养基中，30，180rpm培养，培养时间以之前测出酶活最高点为准。4. 检测各个培养基培养的实验菌株的菌含量及酶活量。五 结果记录一）1. 透明圈-透明圈 图12. 不同淀粉浓度、不同菌浓下涂布培养的菌落

11、数淀粉浓度(g/L)菌悬液的浓度梯度菌落数平均值1010-511010710910-69101010-73539371510-413013713410-5323735二）1 数据记录培养时间/h04812162024283236A5600.0020.0040.0060.0180.1250.1850.0570.0890.8940.543A6600.550.570.5710.5560.5160.4790.0650.0790.0730.0823 绘制出实验菌株的生长曲线和淀粉酶活力图。淀粉酶活力的计算：从下图3做出的标准曲线中，查出对应时间下A660的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量，从而计算出酶活力

12、。培养时间/h04812162024283236A6600.550.570.5710.5560.5160.4790.0650.0790.0730.082淀粉浓度/%1.7211.7781.7801.7381.6241.5190.3430.3830.3660.391消耗淀粉量/(mg/ml)2.7932.2242.1962.6223.7594.81016.57116.1716.34416.088酶活力1.3961.1121.0981.3111.8792.4058.2868.0878.1728.044图 2OD560值随时间的推移总体呈现先升高后下降的走势，即在一段时间内枯草芽孢杆菌量不断增加，超

13、过这一时间后由于营养物质的减少，细菌数量反而减少。淀粉酶的活力也是随时间推移先升高后下降。三）淀粉酶活力标准曲线。图 3四) 绘制出各个碳源对实验菌株生长和产酶的影响图，并用文字加以说明。不同碳源A560A660葡萄糖0.8170.287可溶性淀粉0.8970.037果糖0.7850.28蔗糖0.6380.414乳糖0.5260.019图4 不同碳源对实验菌株生长量由大到小顺序为：可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖。图5不同碳源对实验菌株产酶酶活力由大到小顺序为：乳糖、可溶性淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖。综上两图，以淀粉为碳源就可得到较多的菌株以及产生较多的淀粉酶。六思考题1. 如若通过鉴别性培

14、养基鉴定该实验菌株不产生透明圈，是否可以认定该菌就不产淀粉酶？原因是什么？ 不可以。可能产生的淀粉酶过少，透明圈不明显；培养时间不够，还没有开始产淀粉酶。2 如果每次从同一摇瓶中取出1mL进行测定，会对结果产生怎么样的影响？ 可能会使后面的吸光值变小，每次取出一些，会使培养液含量减少，营养物质变少，从而影响菌的繁殖与生长，那么就不是单个因素时间不同而已，培养基量也不同，做出的曲线不准确。3 本实验中产物形成量用淀粉酶活力来表征，是否合适？为什么？ 合适。产生的淀粉酶用来分解淀粉正好是酶活力在此次试验的定义即以每毫升粗酶液在40，pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数。4 根据实验所得曲线，

15、我们可以得到哪些结论？ 一段时间内枯草芽孢杆菌量不断增加，超过这一时间后由于营养物质的减少，细菌数量反而减少。而酶的活力也随时间先升后降，此处有一个最佳的培养时间，也就酶活力最高时的时间。这个时间用于培养基条件的优化时的培养时间。5. 查阅相关资料，提出切实可行的提高酶活量的相关措施。1）培养基的成分以及含量应该选择最佳的量；2）最佳的培养时间和温度； 3) 保藏的菌种在用于发酵生产时，先接种于新鲜固体培养基上活化，使细胞生命活性恢复；4)温度、pH等条件适宜。6. 根据本实验设计的思路，请设计考察不同氮源的种类及含量对实验菌株生长和产酶的影响。 1）将实验菌株接种至新鲜的基本培养基中，30C培养过夜。 2) 查阅资料，选定培养基中氮源的含量，计算出对应的植物蛋白、牛肉膏、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵的量（以碳含量相同为准则）；配置相应培养基。3) 将上述菌悬液以0.2ml的接种量接种至各个培养基中，30，180rpm培养，培养时间以之前测出酶活最高点为准。4） 检测各个培养基培养的实验菌株的菌含量及酶活量。七实验小结 在此次实验中有很多要注意的事项，微生物的发酵的实验要绝对的注意无菌的操作，这是实验的关键也是最大的前提。在将实验菌株从平板上用无菌生理盐水冲下时，要注意一定要冲洗干净，并且迅速的进行梯度的稀释以及涂布，在吸取菌悬液是，要晃动下以免菌沉聚在底层，而没有