产细菌素乳酸菌的筛选及鉴定

1、产细菌素乳酸菌的筛选及鉴定摘 要：采用琼脂平板扩散实验，从湖南传统发酵腊肉和香肠中筛选出3株对单核增生李斯特菌（Listeria monocytogene54002）具有明显抑制作用的乳酸菌，排除酸和过氧化氢的干扰后，仍具有抑菌活性，而用胰蛋白酶和胃蛋白酶处理以后，其抑菌活性消失，因此确定该抑菌物质为蛋白质类物质，即细菌素。三株菌所产细菌素具有一定热稳定性，在pH510之间仍具有一定的抑菌活性。通过生理生化实验和16S rRNA基因序列分析对3株菌进行了鉴定。PCR扩增得到1600bp左右的16S rRNA基因序列，将序列通过BLAST软件在NCBI网站上进行同源性对比，并通过MEGA5.0软

2、件绘制系统发育树。结果显示3株菌的16S rRNA序列和数据库中的屎肠球菌的序列同源性均在99%以上，这与生理生化实验初步鉴定结果一致。关键词：细菌素，筛选，屎肠球菌Identification and screenging of bacteriocin-producing lactic acid bacteriaAbstract：Three lactic acid bacterium were isolated from Hunan traditonal fermented meats，which exhibitedstrong inhibitory activity against Lis

3、teria monocytogenes 54002. After eliminating the interference factors suchas the organic acids，hydrogen peroxides，the inhibitory activity still existed. But inhibitory activity was lost aftertreatment with trypsin and pepsin. Therefore，the inhibiotory substance could be classed as bacteriocin. Theba

4、cteriocin exhibited good thermal stability and its active pH range from 510. The three bacteriocin-producingbacteria were identified on the base of physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA genesequence. The sequence fragments around 1600bp 16S ribosomal RNA were amplified from tota

5、l DNA of thethree isolated strains by PCR. The sequence was completed by the application of BLAST on the websites ofNCBI and phylogenetic tree was drawn with MEGA5.0. According to the high homology of 16S rRNA sequence，the three bacteriocin-producing bacteria was identified as Enterococcus faecium.K

6、ey words：bacteriocin；screening；Enterococcus faecium细菌素是由某些细菌产生的一类抑菌物质，是由细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类多肽类物质1。细菌素的抑菌范围一般包括一些亲缘关系相近的细菌，而产生菌对其细菌素具有自身免疫性。目前研究最为深入的细菌素是乳酸链球菌肽（Nisin），又称乳酸链球菌素，是由乳酸链球菌产生的一种多肽，它于1969年得到FAO和WHO的认可，是唯一允许作为防腐剂在食品中使用的细菌素，虽然细菌素已被许多国家允许作为食品添加剂放入食品中，但是也存在很大的缺陷，比如抑菌谱较窄，抑菌活性在碱性条件下不稳定2等，寻找高产细

7、菌素以及更稳定的细菌素成为研究的热点。作为细菌素的主要产生菌，乳酸菌生境广泛，数量众多。近年来，国内外学者为获得结构新颖、抑菌活性更为稳定的细菌素，广泛地从当地传统的发酵食品中，尤其是发酵肉制品中进行产细菌素乳酸菌的分离筛选。如deCarvalho从意大利salami香肠中3分离到一株能抑制李斯特氏菌的乳酸菌，Noonpakdee4从泰国传统发酵香肠nham 中分离到一株产 Nisin 的乳酸乳球菌；Martinis5从巴西传统发酵肉制品中共分离得到三株产细菌素乳酸菌，抑菌结果显示，三株菌都具有较强的抑制李斯特氏菌能力；Todorov6从葡萄牙传统发酵猪肉制品中分离到两株产细菌素的植物乳杆菌，

8、而212生 物 工 程2013年第20期Vol . 34 , No . 20 , 2013菌株 发酵原液 调pH调pH+过氧化氢酶TRS5 13.1 13.0 12.7TRS6 12.7 10.7 10.5HY07 13.7 12.7 11.6表1筛选菌株的抑菌作用（mm）Table 1 Inhibitory activity of the three isolated strains（mm）我国学者则多从四川腊肉香肠7、宣威火腿8、泡菜9-11、传统乳制品12-13等发酵食品中分离得到产细菌素的乳酸菌。本研究旨在从我省传统的自然发酵肉制品中（如腊肉、香肠）分离筛选产细菌素的乳酸菌菌株，对充分

9、挖掘本地传统发酵食品中的乳酸菌资源具有一定的理论和实践意义。本文报道了来源于发酵肉制品中的三株产细菌素的乳酸菌-屎肠球菌的分离和鉴定结果。1 材料与方法1.1 材料与仪器腊肉、香肠 市售；单增李斯特菌54002、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 为本实验室保藏菌种；MRS培养基 胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸粉5.0g、柠檬酸三铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温-801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.25g、琼脂15.0g、水1L、pH=6.07.0；BHI培养基 胰蛋白胨17.0g、大豆胨3.0g、酵母浸粉6.0g、氯化钠5.0g、

10、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g、琼脂7.5g、水1L。DNP-9272BS-型生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；普光HH-8型数显恒温水浴锅 上海浦东物理光学仪器厂；LDZX-50FBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；TGL-20M型离心机 长沙英泰仪器有限公司；雷磁pHs-3C型pH计 上海精科。1.2 实验方法1.2.1 初筛1.2.1.1 单核增生李斯特菌菌液制备 将活化过夜的单增李斯特菌按2%接种至BHI培养基中，37培养至稳定期，备用。1.2.1.2 产细菌素乳酸菌的初筛 将市售的湖南传统发酵肉制品称

11、取25g，切碎放置于225mL无菌生理盐水中，摇匀，制备系列稀释溶液，选取合适稀释度的稀释液，移取0.1mL涂布于MRS固体平皿中，培养（242）h。将单增李斯特菌菌液0.1mL与100mL溶化后并保持在50左右的BHI半固体培养基进行混合，混匀后轻轻倒在长有乳酸菌菌落的MRS培养基上层，待培养基凝固后将平板继续培养20h，选取有抑菌圈的菌株，进行菌落的挑取，在MRS培养基平板上划线纯化、保存。1.2.2 复筛1.2.2.1 琼脂扩散法 参考OConnor和岳喜庆的方法14-15。将单核增生李斯特菌菌液0.1mL与100mL溶化后并保持在50左右的BHI固体培养基进行混合，倾注平板，待培养基凝

12、固后轻轻放置无菌牛津杯，在牛津杯中加入0.2mL乳酸菌培养液，37培养12h，观察抑菌圈大小，用测量尺测量抑菌圈直径。1.2.2.2 有机酸的排除 将纯化后的菌株在液体MRS培养基中培养24h，用1mol/L NaOH将培养液的pH调至6.006.50，1000g 10min离心，取上清液，采用琼脂扩散法观察能否产生抑菌圈。1.2.2.3排除过氧化氢的干扰 参考姚丽娅的方法16。将过氧化氢酶溶解于50mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH=7）中，将过氧化氢酶加入以调pH至7左右的发酵上清液当中，使终浓度为50mg/L，在37水浴锅中温浴2h，然后用琼脂扩散法观察加入过氧化氢酶后有无抑菌圈出现。1.

13、2.3抑菌物质的初步鉴定 将胃蛋白酶和胰蛋白酶分别溶解于pH=3和pH=6磷酸盐缓冲液中，加入已经调好相应pH的发酵上清液中，使酶的终浓度为0.5mg/L，37温浴2h，然后再将处理后的发酵液上清pH调至67，做相应处理但未加酶的进行对照17。琼脂扩散法比较抑菌圈的大小。1.2.4 细菌素稳定性研究 参考刘国荣的方法181.2.4.1 热稳定性 将活化后的乳酸菌菌液按接种量1%接种至MRS培养液中，培养24h，离心后取上清液，调节pH=6，分别取一定量的上清液于40、60、80、100、120条件下处理20min，待冷却至室温后，琼脂扩散法进行抑菌实验，和未处理的进行比较。1.2.4.2 酸稳

14、定性 将活化后的乳酸菌菌液按接种量1%接种至MRS培养液中，培养24h，离心后取上清液，分别取适量上清液，将pH分别调至5、6、7、8、9、10，以及原液进行抑菌性，观察抑菌效果有无差别。1.2.5 产细菌素菌株的鉴定1.2.5.1 菌落形态及生理生化实验 革兰氏染色后进行显微镜下细胞形态的观察。生理生化实验包括：产酸产气实验、精氨酸产氨实验、淀粉水解实验、明胶液化实验、硫化氢实验等。1.2.5.2 16S rRNA序列鉴定 乳酸菌基因组DNA的提取按照天根生化科技有限（北京）有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。16S rRNA基因序列PCR扩增引物分别为：正向引物27F：5-AGA

15、GTTTGATCCTGGCTCAG-3；反向引物 1541R：5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3。引物的合成和PCR产物的测序由华大基因完成。PCR反应条件：95预变性5min，94变性30s，55复性30s，72延伸1min 30s，30次循环，最后72延伸10min。测定后的16S rRNA基因序列登陆NCBI进行BLAST比对，并利用MEGA 5.0软件进行进化树的构建。2 结果与讨论2.1 产细菌素乳酸菌的筛选利用双层琼脂的方法，共从市售的湘味腊肉和香肠中初筛出8株具有抑菌作用的菌株。2.1.1 有机酸和过氧化氢的排除 将培养过夜后的乳酸菌上清液，用1mol/L NaOH将上清

16、液pH调整到6.0左右，有三株菌的上清液仍具有抑菌活性，说明发酵上清液的抑菌效果不是由有机酸引起的。在用过氧化213Science and Technology of Food Industry生 物 工 程2013年第20期图2 细菌素在pH下的稳定性Fig.2 pH sensitivity of bacteriocinpH对照 5 6 7 8 9 1014121086420抑菌圈直径（mm）TRS5TRS6HY07氢酶处理发酵上清液后，抑菌效果也未见明显变化，由此排除过氧化氢的影响。发酵上清液中存在其他的抑菌活性物质（见表1）。将其上清液经过胃蛋白酶和胰蛋白酶酶处理后（见表2），抑菌效果消

17、失，证明抑菌物质为蛋白类物质，初步认为是细菌素。将三株产细菌素的乳酸菌分别命名为HY07、TRS5、TRS6。2.1.2蛋白酶对发酵上清液的敏感性 将培养过夜后的乳酸菌上清液，经过胰蛋白酶、胃蛋白酶处理以后，抑菌活性完全丧失，因此可确定发酵上清液中的抑菌活性物质是蛋白质类物质，为细菌素（表2）。2.2 细菌素的稳定性研究2.2.1 热稳定性 将发酵上清液分别经过40、60、80、100、120处理20min，与原液的抑菌效果相比较，由图1可知，在4080之间，三株乳酸菌发酵液均具有抑菌活性。但随着处理温度的不断提高，抑菌圈的直径逐渐减小，表明抑菌活性降低，在100时，只有HY07对单增李斯特菌

18、具有一定的抑菌活性，120处理三株菌的菌液抑菌活性均丧失，这种抑菌活性的变化规律与报道过的细菌素一致8。2.2.2 酸碱稳定性 发酵液上清液经过酸碱处理后，由图2可见，在pH在510之间，仍具有较高的活性，尤其是在碱性条件下仍有一定的抑菌性。作为常用的食品防腐剂，Nisin在酸性的条件下抑菌活性较强，而碱性的条件则不利于发挥抑菌活性，这导致了Nisin在应用过程中的局限性，所以一定耐碱能力的细菌素具有一定的应用前景。2.3 产细菌素乳酸菌的鉴定2.3.1 HY07、TRS5、TRS6的菌落特征以及个体形态特征HY07、TRS5、TRS6三株菌在培养基上的菌落形态为圆形的白色菌落，无芽孢，革兰氏

19、阳性，不运动，兼性厌氧。2.3.2 生理生化特征 分离到的HY07、TRS5、TRS6三株菌发酵葡萄糖产酸不产气，在10和45都能生长，在6.5%的NaCl中也能生长，其他的的生理生化实验结果见表3。基本符合文献资料中屎肠球菌的特征，初步确定为屎肠球菌（E. faecium）。2.3.3 16S rRNA基因序列分子生物学鉴定 以筛选到的三株产细菌素的乳酸菌基因组DNA为模板，进行16SrRNA基因序列的PCR扩增，得到的约1600bp产物纯化后连接测序载体，将测序后得到的序列进行BLAST比对，通过比对发现HY07、TRS5、TRS6与E. faecium有超过99%的同源性，结合生理生化实

20、验结果，可以鉴定筛选到的三株产细菌素的乳酸菌为屎肠球菌。菌株 对照 胰蛋白酶 胃蛋白酶TRS5 + TRS6 + HY07 + 表2 蛋白酶对细菌素抑菌活力的影响Table 2 Effect of different proteases on the antibacterialactivity of bacteriocin注：“+”表示有抑菌效果，“”表示无抑菌现象。图1 细菌素的热稳定性Fig.1 Thermal stability of bacteriocinT（）对照 40 60 80 100 12014121086420抑菌圈直径（mm）TRS5TRS6HY07生理生化实验 实验结果

21、生理生化实验 实验结果过氧化氢酶 氧化酶 L-阿拉伯糖 木糖 D-核糖 葡萄糖 甘露糖 纤维二糖 鼠李糖 蔗糖 乳糖 麦芽糖 蜜二糖 海藻糖 棉子糖 半乳糖 水杨苷 山梨醇 表3 菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical features of HY07，TRS5，TRS6注“：+”代表阳性；“”代表阴性。HY07Enterococcus faecium ML768TRS5Enterococcus durans strain GM20Enterococcus mundtii strain C4L10Enterococcus dispar st

22、rain BB11Enterococcus faecalis strain B10L7Enterococcus rivorum strain Z S TSA 23TRS6809472951000.005图3基于筛选菌株16S rDNA序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence ofstrains HY-7，TRS-5 and TRS-6214生 物 工 程2013年第20期Vol . 34 , No . 20 , 2013对烟曲霉XD-9菌株的5-PDE的催化特性及结构的进一步研究将可以揭示该酶的本质，并丰富

23、人们对核酸酶家族的进一步了解。参考文献1 DHULE S S，SHETTY P R，IYER J L，et al. Purfication andcharacterization of 5-phosphodiesterase from germinated barleyJ. Process Biochem，2006，41（8）：1899-1902.2 YING Guo -Qing，SHI Lu -E，YU Yi，et al. Production，purification and characterization of nuclease P1 from PenicilliumcitrinumJ

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28、生物化学与分子生物学报，2005，21（2）：278-281.3 结论本研究从湖南传统发酵肉制品中，筛选出具有一定抑菌能力的乳酸菌，在排除酸和过氧化氢的影响后，结合蛋白酶酶解等实验，证实分离到的三株乳酸菌能产生细菌素。细菌素的稳定性实验表明，筛选到的乳酸菌产生的细菌素具有一定的酸和热稳定性。根据16S rDNA序列的测定，结合生理生化实验，将三株菌初步归属为屎肠球菌。参考文献1 Koumoutsi A，Chen XH，Henne A，et al. Structural andfunctional characterization of gene clusters directing nonri

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