农杆菌注射渗透法转化烟草实验研究

1、ISSN1002-4956CN11-2034/T实 验 技 术 与 管 理ExperimentalTechnologyandManagement第27卷 第11期 2010年11月Vol.27 No.11 Nov.2010农杆菌注射渗透法转化烟草实验研究黎 茵,张以顺(中山大学生命科学学院生物学实验教学中心,广东广州 510275)摘 要:利用携带植物表达载体质粒pCambia2301的农杆菌菌株,通过注射渗透法对烟草叶片进行感染转化,组织化学染色检测GUS报告基因瞬时表达的结果表明,在O.D.600值为0.40.8范围内的菌液浓度不影响转化效果,感染时间72h以上可使瞬时表达的阳性检出率达到

2、100%,农杆菌菌株EHA105比LBA4404表现出更强的转化活性。关键词:烟草;瞬时转化;根癌农杆菌;渗透法中图分类号:Q943.2;S572 文献标志码:A 文章编号:1002-4956(2010)11-0050-03Studyonagrobacteriumtumefaciens-mediatedtransienttransformationoftobaccobyinfiltrationLiYin,ZhangYishun(BiologyExperimentTeachingCenter,SchoolofLifeSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou5

3、10275,China)Abstract:TransientexpressionofreportgeneGUSintobaccoepidermalcellsisperformedbytheagrobacter-iumtumefaciens-mediatedtransienttransformationsystemwithplantexpressionvectorpCambia2301.Theex-pressionratiosarestablewhenthefinaldilutionofbacterialcellsO.D.600isbetween0.4-0.8.Highestex-pressio

4、nisupto100%requiringonly72hfrominfiltration.AgrobacteriumtumefaciensstrainEHA105givesstrongertransformationactivitythanstrainLBA4404.Keywords:tobacco;transienttransformation;agrobacteriumtumefaciens;infiltration植物的遗传转化是生物技术中的一个十分重要的领域,烟草作为重要的模式植物是最早实现基因转化和应用的植物之一。植物转化的常用方法有农杆菌介导法、基因枪法等。使用农杆菌介导的叶片注射渗

5、透法转化烟草进行基因瞬时表达,是近几年来在基因功能检测、蛋白作用机理研究方面使用较多的快速转化技术1-2,该技术的最大优点是方便快捷,感染组织面积大,转化细胞数量多3。我们在近年的实验教学中引入这一实验技术,不仅能避免通过组织培养的转化方法的耗时长、操作复杂、容易污染等问题,还可以在较短时间内完成从转化到报告基因表达检测的过程。收稿日期:2009-12-22 修改日期:2010-03-18基金项目:中山大学教学改革项目(1163125);中山大学实验教学研究(改革)基金项目(YJ200921)作者简介:黎茵(1969),女,广东省梅县人,博士,讲师,研究方向:植物分子生物学.E-mail:li

6、yin通信作者:张以顺(1966),男,贵州省毕节市人,博士,高级工程师,中山大学国家级生物学实验教学中心副主任,研究方向:植物分子生物学.E1 实验原理农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以通过复制转移进入植物细胞并整合到植物细胞的基因组中,从而在转化的植物细胞中表达T-DNA(transferDNA)中编码的基因。利用农杆菌的这一特性可以通过构建T-DNA片段中带有外源基因的植物转化载体,通过农杆菌介导进行植物细胞和组织的遗传转化。本实验采用的植物表达载体是pCambia23016(见图1),该载体T-DNA上带有35S启动子驱动的B-葡萄糖苷酸酶(B-glucuronidase,GUS)报告基

7、因,将该载体转入农杆菌菌株,利用注射法转化烟草叶片。由于B-葡萄糖苷酸酶能够通过水解B-葡萄糖苷酸酯类底物而生成蓝色化合物,因此通过组织化学染色可以检测报告基因的瞬时表达。4-52 实验仪器、材料与试剂2.1 仪器超净工作台(苏州净化设备有限公司,SW-CJ-机黎 茵,等:农杆菌注射渗透法转化烟草实验研究51过夜,菌液浓度达到O.D.600值为0.81.0。(3)菌液分别经40000g离心弃去LB培养基,菌体悬浮于10mmolMgCl2中,添加乙酰丁香酮(As)至终浓度200Lmol/L,悬浮液的浓度调整到O.D.600值为0.5左右,2528e静置活化3h。(4)用一次性注射器分别吸取1mL

8、菌液,取针头在受体叶片上轻刺23个小孔,将注射器压在针孔部位,以手指抵住叶片下部,轻轻用力将注射器内菌液压送并渗透到叶片组织中(见图2),用标记笔在注射部位上做好标记。图1 pCambia2301载体图谱(Eppendorf,5810R);电转仪(BTX,ECM399);光照培养箱(宁波江南仪器厂,GXZ-128A)或培养室;恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司);电子天平(Sar-torius,BS224S)。另有镊子、培养皿、三角瓶、试管、容量瓶、注射器等。2.2 材料烟草(NicotianatabacumcvXanthi)为12月龄植株;农杆菌菌株LBA4404和EHA1057;植物表

9、达载体pCambia2301。2.3 试剂(1)LB培养基:含胰化蛋白胨,体积质量为10g/L;酵母提取物,体积质量为5g/L;NaCl体积质量为10g/L,固体培养基加入1.5%琼脂,灭菌备用。(2)卡那霉素母液:50g/LKan溶液,-20e保存。(3)乙酰丁香酮(As)母液:用二甲基亚砜配成200mmol/L溶液,-20e保存。(4)10mmolMgCl2溶液,灭菌,使用前加入200Lmol/L的乙酰丁香酮(As)。(5)X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-B-葡萄糖苷酸酯)染色液8:50mmol磷酸缓冲液(pH7.2),含1mmolX-Gluc,2mmolK4FeCN6,2mmol

10、K3FeCN6。(6)体积分数为70%乙醇。图2 烟草叶片注射示意图(5)经注射的烟草植株在25e下,在14h光照和10h暗的光周期下培养34d。(6)剪取注射部位进行GUS组织化学染色检测,叶片材料剪成916mm2小片,并置于X-Gluc染色液中,染色216h。(7)用70%乙醇脱色至叶绿素完全除去,观察对比有无GUS表达染色现象,记录并拍照。4 结果与分析4.1 农杆菌菌株对瞬时表达的影响农杆菌EHA105比LBA4404具有较强的侵染毒性,因此在一些转化困难的植物中使用EHA105菌株的转化效果比较好。在本实验中,EHA105也比LBA4404表现出更强的转化活性,在较短时间内瞬时转化率

11、较高,并且由于转化效率高而导致的表达产物积累更多,使组织化学染色的强度也更高,见表1(表中+号越多表示越强)。实验中发现注射时悬浮菌液的浓度在O.D.600值为0.40.8之间效果相同,对转化效率和染色强度无明显影响,但浓度过低则染色强度会明显降低,而浓度过高则由于过多死亡菌体的存在容易导致注射部位叶片组织坏死。3 实验方法(1)用于烟草叶片注射的植物表达载体通过电击法9转化入农杆菌中,菌种于-70e保存。(2)带有转化载体质粒的农杆菌和无转化载体的对照菌株在含50mg/LKan的LB平板上划线复苏,52实 验 技 术 与 管 理表1 农杆菌菌株及感染时间对GUS基因瞬时表达的影响感染时间/h

12、24487296LBA4404菌株阳性检出率/%染色强度018100100无+EHA105菌株阳性检出率/%040100100染色强度无+图3 烟草叶片GUS基因瞬时表达组织化学染色结果4.2 感染时间对瞬时表达的影响农杆菌转化植物细胞需要经历一段时间,从菌体与细胞接触到T-DNA的复制和转移需要超过16h的时间,因此需要在感染后培养足够时间才可以进行有效的报告基因瞬时表达检测。实验结果表明,在37e染色16h的检测条件下,注射后24h的叶片组织检测不到明显的表达,48h后部分烟草叶片组织可以在染色后观察到颜色较浅的染色结果,注射后34d报告基因的表达检出率达到100%,由于GUS蛋白在植物组

13、织中可以比较稳定地累积10构等研究外,也可以在植物果实等其他组织中实施注射法转化12。本实验对影响烟草叶片注射转化法的多项因素进行研究,优化实验体系,确定适宜的转化条件,不仅可以很方便地将该转化体系应用于本科教学的实践中,也可以利用本方法进行植物转基因操作和基因功能的检测研究。参考文献(References):1ZhangShuqun,LiuYidong.ActivationofSalicylicAcidInducedProteinKinase,aMitogen-ActivatedProteinKinase,InducesMul-tipleDefenseResponsesinTobaccoJ.

14、ThePlantCell,2001(13):1877-1889.2SparkesIA,RunionsJ,KearnsA,etal.Rapid,transientexpres-sionoffluorescentfusionproteinsintobaccoplantsandgenerationofstablytransformedplantsJ.NatureProtocols,2006,1(4):2019-2025.3CazzonellivCI,VeltenJ.Aninvivo,luciferase-based,Agrobacte-rium-infiltrationassaysystem:imp

15、licationsforpost-transcriptionalgenesilencingJ.Planta,2006(224):582-597.4王关林,方宏筠.植物基因工程M.2版.北京:科学出版社,2002:372-395.5HoekemaA,HirschPR,HooykaasPJJ,etal.Abinaryplantvectorstrategybasedonseparationofvir-andT-regionoftheAgrobacteriumtumefaciensT-iplasmidJ.Nature,1983(303):179-80.6pCambia2301EB/OL.(2006-0

16、8-11)./daisy/cambia/2067/version/1/part/4/data/pCAMBIA2301.branch=main&language=default7HoodEE,GelvinSB,MelchersLS,etal.NewagrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplantsJ.TransgenicRe-search,1993(218):208-218.8JeffersonRA.Assayingchimericgenesinplants:theGUSgenefusionsyst

17、emJ.PlantMolecularBiologyReporter,1987(5):387-405.9萨姆布鲁克J,拉塞尔DW.分子克隆实验指南M.3版.黄培堂,译.北京:科学出版社,2002:99-102.10McintoshKB,HulmJL,YoungLW,etal.ARapidAgrobacte-rium-MediatedArabidopsisthalianaTransientAssaySystemJ.PlantMolecularBiologyReporter,2004(22):5361.11VeltenJ,MoreyKJ,CazzonelliCI.Plantviralintergen

18、icDNAsequencerepeatswithtranscriptionenhancingactivityJ.Virolo-gyJournal,2005(2):16-26.12孟楠,刘月学,孙立茹,等.农杆菌注射法转化草莓果实细胞的研究J.沈阳农业大学学报,2009,40(4):404-407.pdf?11,感染后较长时间的叶片组织染色强度也较高,检测效果更为明显。4.3 组织化学染色条件的优化由于检测GUS基因瞬时表达的组织化学染色方法所采用的是活组织染色,控制好染色条件是得到较好染色结果的关键。首先剪取材料时应尽量减少叶片细胞的损伤,取样后立即进行染色。如果有条件对加入染色液的材料进行真空处理5min,能有效促进染色液渗入组织,加强染色效果和均匀度;未经真空处理的染色材料