大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化

1、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备的原理：大肠杆菌自然条件下很难进行转化，其主要缘由是转化因子的吸取较为困难。在转化试验中，通常先接受人工的方法制备感受态细胞，代表性的方法之一是Ca2+诱导法。感受态形成后，细胞生理状态会发生转变，消灭各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化：在0的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。Ca2+能与加入的DNA分子结

2、合，形成抗DNA酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生猛烈扰动，并随之消灭很多间隙，为DNA分子供应了进入细胞的通道。一、 受体菌的培育从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落,接种于3-5ml LB液体培育基中,37下振荡培育12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培育基中,37振荡培育2-3小时至OD600 0.5左右。（OD600值在0.4到0.6之间）二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培育液转入离心管中,冰上放置10分钟,

3、然后于4下3000g离心10分钟。2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4下3000g离心10分钟。3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4、 感受态细胞分装成200l的小份,贮存于-80可保存半年。大肠杆菌感受态过程中的留意事项：1、细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4的培育菌，最好从-80甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培育液的OD600 来把握。DH5菌株的

4、OD600为0.5时，细胞密度在5107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2、全部操作均应在无菌条件和冰上进行；试验操作时要格外当心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体裂开，影响转化。 3、经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，肯定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而削减造成的）； 4、化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； 5、所使用的器皿必需洁净。少量的去污剂或其它化学物质的

5、存在可能大大降低细菌的转化效率；6、所用器具的洁净程度。这一点格外重要，是全部与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。7、培育基的装量。培育基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值：培育基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。8、培育基的pH值。这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2。等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良

6、好，按要求做，确定效率不低。9、培育后的OD值。其实这是一个格外重要的参数，只是当OD值大到肯定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于 0.6、0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，感受态确定数量要大一点。因此需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。10、培育基中的各种离子。阅历证明，当培育基中存在肯定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备一般感受态时，使用20mM MgCl2做为培育基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。11、培育温度。文献及阅历告知我们，较低的温度培育有利于感受态的形成，这样可以获得较高的

7、感受态，但太低又不有用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了全部有利于感受态的文献而得出的一个格外抱负方法。12、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。13、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推举用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。三、 转化1、从-80冰箱中取200l感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后马上置冰上。2、 加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10l),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。3、42水浴中热击90秒或37水浴5分钟,热击后快速置于冰上冷却3-5分钟。4、向管中加入1ml LB液体培育基

8、(无抗性LB),混匀后37振荡培育1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。5、将上述菌液摇匀后取100l 涂布于含抗性（Kana或者Amp）的筛选平板上,正面对上放置半小时,待菌液完全被培育基吸取后倒置培育皿,37培育16-24小时。同时做两个对比:对比组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常状况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落消灭。对比组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常状况下应产生大量菌落。四、 计算转化率统计每个培育皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，依据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积转化频率（转化子数每mg质粒DNA）转化子总数质粒DNA加入量(mg)感受态细胞总数对比组菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积感受态细胞转化效率转化子总数