单链抗体A7基因真核表达载体的构建

1、单链抗体A 7基因真核表达载体的构建【摘要】 目的 构建抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的真核表达载体，为单链抗体A 7基因的真核表达及基因治疗重症肌无力奠定基础. 方法 应用PCR技术，从已构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组原核表达载体pHEN 2单链抗体A 7上扩增单链抗体A 7基因并纯化，将纯化后的PCR产物经EcoR和Avr双酶切后，用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化，再与经同样酶切并纯化的真核表达载体pPIC 9 K连接，将其产物转化至大肠杆菌DH 5 后扩增，再用Avr和EcoR酶切和测定序列检查ScFv A 7基因插入的准确性. 结果 构建pP

2、IC 9 K-ScFv A 7重组载体，经序列测定检查核苷酸序列正确，且ScFv A 7基因准确地克隆至载体开放读码框架内. 结论 成功地构建了抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的真核表达载体. 【关键词】 重症肌无力；抗体；真核表达载体 ABSTRACT: OBJECTIVE To construct a recombinant eukaryoic expression vector of the single chain variable fragment (ScFv) A 7 of antibody against the main immunogenic region (MI

3、R) of acetylcholine receptor (AChR) for the further eukaryoic expression and the gene therapy in myasthenia gravis (MG). METHODS The ScFv A 7 gene was amplified by PCR from the recombinant prokaryotic expression vector pHEN 2-ScFv A 7, then purified and digested with EcoRand Avr. The digested produc

4、ts were run in low melting point agarose gel eletrophoresis and purified by Wizard PCR Preps DNA Purification System, then ligated into eukaryotic expression vector pPIC 9 K digested and purified by the same method. The recombinant vector pPIC 9 K-ScFv A 7 was transformed into E. coli DH 5 for ampli

5、fication and isolated and digested with Avr and EcoR again. The pPIC 9 K-ScFv A 7 gene was analysed for an insert of the right size by digestion with Avr and EcoR. RESULTS The sequencing showed that the nucleotide sequence of constructed ScFv A 7 was correct and cloned into the open reading frame (O

6、RF) in pPIC 9 K. CONCLUSION The recombinant eukaryoic expression vector pPIC 9 K-ScFv A 7 has been successfully constructed. Key words:myasthenia gravis;antibodies;eukaryotic expression vector 重症肌无力是抗乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor, AchR）抗体介导的器官特异性自身免疫病,AchR是由 2 等5个同源亚单位组成的跨膜糖蛋白1.现已发现,重症肌无力患者血清中2/3的抗A

7、chR抗体针对的是亚单位的主要免疫原区的第6776位氨基酸表位2.当致病性抗体与神经肌肉接头处突触后膜上相邻2个AchR 亚单位上的主要免疫原区结合后，通过抗原调变或激活补体作用使突触后膜损伤3，AchR数量减少，结果出现受累肌肉收缩无力及麻痹症状4.由抗AchR抗体制备的单链抗体（single chain variable fragment，ScFv）作为单价片段，只能与1个亚单位上的主要免疫原区结合，不引起抗原调变作用，且单链抗体无可结晶片段（Fc），不能激活补体导致AchR损伤.但单链抗体与主要免疫原区结合后，可特异性地封闭抗AchR抗体的结合位点，从而对AchR起到保护作用.本实验将构

8、建在原核表达载体pHEN 2上的抗AchR主要免疫原区单链抗体A 7（ScFv A 7）基因克隆至真核表达载体pPIC 9 K上，构建了重组真核表达载体. 1 材料与方法 1.1 菌种与载体 肠杆菌DH 5 由荷兰马斯特里赫特大学医学院神经学系神经免疫学实验室提供，载体质粒pPIC 9 K由军事医学科学院输血研究所章金刚教授惠赠，大肠杆菌HB 2151（pHEN 2-ScFv A 7）由本实验室构建. 1.2 试剂 Wizard Plus Minipreps/ Midipreps Purification System, Wizard PCR Preps DNA Purification Sy

9、stem为美国Promega公司产品，High Fidelty PCR System-5 Kb为华美生物工程公司产品，DL 2000/2000+15000 DNA标志物为日本TAKARA大连分公司产品，限制性核酸内切酶EcoR，Avr,T 4 DNA连接酶为美国NEB公司产品，A 7 VH 5和A 7 myc 3引物由上海Sangon生物工程公司合成. 1.3 pHEN 2-ScFv A 7和pPIC 9 K的提取与纯化 将-80 保存的大肠杆菌HB 2151（pHEN 2-ScFv A 7）和大肠杆菌DH 5 （pPIC 9 K）各接种于5 mL LB培养基（含100 mg/L Amp）中，

10、37 过夜振荡培养.将培养物分离划线在LB平板培养基（含100 mg/L Amp）上，37 培养直至长出菌落.分别从平板中挑选单个菌落各接种于100 mL LB培养基（含100 mg /L Amp）中，37 过夜振荡培养.pHEN 2-ScFv A 7和pPIC 9 K的提取及纯化分别按Wizard Plus Minipreps DNA Purification System, Wizard Plus Midipreps DNA Purification System试剂盒说明书进行. 1.4 PCR扩增及产物纯化 根据ScFv A 7前10位氨基酸设计A 7 VH 5引物ATGAATTCCC

11、AGGTGCAGCGCAGGAGTCAGGGGGAGGC，根据ScFv A 7后连接的c-myc的最后8位氨基酸的互补核苷酸序列设计A 7 myc 3引物AACCTAGGATTCAGATCCTCTTCTGAGATG,划线部分为引入的酶切位点.PCR反应体系如下：在50 L总反应体积中依次加入蒸馏水27.5 L，20×PCR反应缓冲液（氯化镁-Free）2.5 L，氯化镁3 L，dNTPs（10 mmol/L）1 L，A 7 VH 5和A 7 myc 3引物（10 mol/L）各1.5 L，pHEN 2-ScFv A 7（0.05 g/L）10 L，Pfu DNA聚合酶1 L（1 U）

12、，Taq DNA聚合酶2 L（2 U），混合后再加入50 L石蜡；10 L蒸馏水代替pHEN 2-ScFv A 7作为阴性对照.反应条件：在PCR仪中进行35次循环，扩增前94 预变性10 min.每个循环为94 变性30 s，55 退火60 s，72 延伸45 s.循环后72 延伸10 min.PCR产物纯化按Wizard PCR Preps DNA Purification System试剂盒说明书进行. 1.5 ScFv A 7基因和载体pPIC 9 K的酶切、纯化及连接 分别对ScFv A 7和pPIC 9 K进行双酶切，ScFv A 7的双酶切反应如下：在50 L的总反应体积中依次加

13、入蒸馏水24 L，10×酶切缓冲液5 L，ScFv A 7（50 mg/L）19 L，Avr（4 MU/L）1 L，EcoR（100 MU/L）1 L，37 反应2 h.pPIC 9 K的双酶切反应如下：在50 L的总反应体积中依次加入蒸馏水24 L，10×酶切缓冲液5 L，pPIC 9 K（0.175 g/L）15 L，Avr（4 MU/L）5 L，EcoR（100 MU/L）1 L，37 反应2 h.将上述2种酶切产物加样于10 mLL的低熔点琼脂糖凝胶板上，在100 V，80 mA条件下电泳1 h.在紫外灯下观察后迅速将含有目的质粒的条带切下，转至1.5 mL离心管中

14、，在70 条件下直至琼脂溶化，加入1 mL树脂混匀20 s，以下步骤同PCR产物纯化.连接反应:在20 L总反应体积中依次加入蒸馏水7 L，10×T 4 DNA连接缓冲液2 L，ScFv A 7（50 mg/L）5 L，pPIC 9 K（0.1 g/L）5 L，T 4 DNA连接酶（400 MU/L）1 L，室温（2025 ）条件下反应1 h. 1.6 重组载体pPIC 9 K-ScFv A 7转化大肠杆菌DH 5 按分子生物学常规操作制备D H 5 感受态细胞后进行转化.取100 L感受态细胞加入20 L连接反应物，冰浴放置30 min，42 条件下热休克90 s，迅速取出置于冰浴

15、内2 min，加入900 L不含Amp的LB培养基，在37 条件下以100 r/min复苏细菌45 min，在4 条件下以4 000 r/min离心5 min，吸弃800 L上清液，用剩余液体重悬细菌.取20,180 L上述液体分别滴加在2个已铺好的LB平板培养基（含100 mg /L Amp）上，1214 h后计数菌落数. 1.7 克隆结果的酶切检查及序列测定 当培养基上长出菌落后，随机在平板上挑取菌落并培养扩增，按Wizard Plus Minipreps DNA Purification System试剂盒说明书纯化重组质粒，纯化后的重组质粒再经EcoR/Avr双酶切后，行琼脂糖凝胶电泳

16、检查，并测定序列，以证实基因是否准确插入. 2 结果 利用PCR方法从pHEN 2-ScFv A 7质粒上扩增ScFv A 7基因，同时在两端引入EcoR和Avr的2个酶切位点，琼脂糖凝胶电泳检查显示约在800 bp处可见清晰条带（Fig 1）.纯化后的PCR产物及载体pPIC 9 K经EcoR/Avr双酶切及低熔点琼脂糖凝胶电泳回收、纯化和连接后，将重组载体转化D H 5 .挑选阳性克隆用纯化试剂盒分离纯化重组质粒，经EcoR/Avr酶切及电泳检查，确认插入基因的准确性，约在800 bp处可见酶切片段（Fig 2）.构建的pPIC 9 K-ScFv A 7重组载体经测定序列检查证实核苷酸序列

17、正确，ScFv A 7基因准确地插入到pPIC 9 K开放读码框架内，长度为807 bp. 3 讨论 酵母是单细胞低等真核生物，既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性，同时又具有适合于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统，还可向培养液中分泌外源蛋白，利于纯化5，6.毕赤酵母的高产量是它之所以吸引人们目光的很重要的原因,而Goel等7构建的二价单链抗体CC 49经实验证实在毕赤酵母中的表达量是在大肠杆菌中表达量的3040倍.Eldin8等报道，在摇瓶中培养单链抗体可获得250 mg/L水平的产量.Freyre等9在发酵条件下，利用毕赤酵母表达系统成功地分

18、泌表达了抗癌胚抗原单链抗体，获得了1.2 g/L的单链抗体表达水平.由于巴斯德毕赤酵母没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型质粒作为外源基因的表达载体.本实验所选用的载体pPIC 9 K是由酵母的部分基因序列和细菌的部分基因序列所组成的，它的原核部分主要包括可在大肠杆菌中复制的起始序列和特定的抗性基因序列，酵母部分包括营养缺陷型选择标记组氨酸脱氢酶基因（HIS 4）10、抗性选择标记kanr基因11、来源于醇氧化酶-1（AOX1）基因5端的启动子序列的0.9 kb片段和来源于AOX 1基因转录终止序列的0.9 kb片段、多克隆位点和-因子信号肽序列.pPIC 9 K的多克隆位点上有SnaB，E

19、coR，Avr,Not等4个可供插入的酶切位点，但由于目的基因ScFv A 7上存在酶切位点Not，而SnaB酶切后为平末端，因此本实验选用了EcoR,Avr的2个酶切位点.在PCR引物设计时目的基因ScFv A 7两端分别引入了EcoR,Avr酶切位点.实验选用双酶切方法可不必考虑在单酶切时为防止载体自身连接和环化而对其末端再进行磷酸化，也可避免平末端连接困难的问题，同时双酶切也不必考虑克隆后鉴定外源基因在重组子中的连接方向.连接反应中，目的基因与载体二者比例适合是消除载体自身连接和片段多拷贝准确插入的关键，通常以摩尔数比例计算，插入片段与载体的适合比例为5110112.本实验中连接反应条件

20、根据NEB公司的T 4 DNA连接酶使用说明，应用室温连接反应方法，即室温条件下在20 L反应体系中加入1 L（400 U）T 4 DNA连接酶反应1 h，插入片段与载体的比例约为51.本实验将来源于致病性抗AchR单克隆抗体A 7的单链抗体ScFv A 7基因克隆至真核表达载体上，成功地构建了重组真核表达载体，以期进一步转入酵母菌进行真核表达而获得更高水平的ScFv A 7产量，为重症肌无力的基因治疗奠定了基础. 【参考文献】 1 Skerra A, Pluckthun A. Assembly of functional immunoglobulin Fv fragment in Esche

21、richia coliJ.Science,1988,240:1 038.2 Tzartos SJ, Swybold ME, Lindstrom JM.Specificities of antibody to acetylcholine receptors in sera from myasthenia gravis patients measured by monoclonal antibodiesJ.Proc Natl Acad Sci USA,1982,79(1):188.3 Verma R, Boleti E, George AJ.Antibody engineering: compar

22、ison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systemsJ.J Immunol Methods,1998, 216:165.4 Mukherjee KJ, Rowe DC, Watkins NA, et al.Studies of single-chain antibody expression in quiescent Escherichia coliJ.Appl Environ Microbiol,2004,70(5): 3 005.5 Barr PJ, Steimer KS, Sabin EA, et al.Ant

23、igenicity and immunogenicity of domains of the human immunodeficiency virus (HIV) envelope polypeptide expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiaeJ.Vaccine,1987,5:90.6 Liu YY, Woo JH, Neville DM.Overexpression of an anti-CD 3 immunotoxin increases expression and secretion of molecular chaperone

24、BiP/Kar2p by Pichia pastorisJ.Appl Environ Microbiol,2005, 71(9):5 332.7 Goel A, Beresford GW, Colcher D, et al.Divalent forms of CC 49 single-chain antibody constructs in Pichia pastoris:expression, purification and characterizationJ.J Biochem,2000,127(5):829.8 Eldin P, Pauza ME, Hieda Y, et al.High-level secretion of two antibody single chain Fv fragments by Pic