细胞工程第三章细胞培养基本方法

1、细胞工程第三章细胞培养基本方法一、无菌操作技术根据使用器材不同选择正确合适的方法进行消毒和灭菌。地面：0.1%新洁尔灭或2-5%来苏尔灭菌，紫外线照射30-50min；超净工作台及器具：每次实验前95%酒精擦拭消毒，紫外线照射消毒。3.洗手和着装：口罩、无菌服、帽子紫外线照射消毒；手部消毒。4.无菌培养操作：无菌操作技术要领无菌操作技术要领点燃酒精灯：加热消毒。动作准确敏捷 ：不应太快。不用手触及已消毒物品 操作面布局合理 操作保持一定顺序 培养用瓶和吸管的放置 防止各种用液的交叉污染不向操作者讲话或咳嗽维护各种设备，保持良好工作状态。超净台内培养用品布局 二、培养细胞的观察（一）相差显微镜观

2、察（一）相差显微镜观察1.原理：利用光在通过不同密度物质时的折射率和物体厚度差别，由于折射光程不同产生衍射而引起的光程变化。产生衍射而引起的光程变化。光程的变化引起相位差相位差变化来观察物体结构。一般情况下人眼不能分辨相差，而相差显微镜利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差及明暗之差相差变为振幅差及明暗之差，就可以分辨出被检物体的结构。 2.生长良好的细胞的镜下状态：细胞透明度大，折光性强，轮廓清。细胞透明度大，折光性强，轮廓清。 相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。 B.若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态

3、不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。发现这种情况应及时处理。（二）倒置显微镜（二）倒置显微镜1.光源和聚光器位于载物台上方。2.物镜位于载物台下方。3.载物台上可放置培养皿，便于观察贴服于底壁上的活细胞。4.倒置显微镜可装配各种辅助设备：相差长焦距聚光器、暗视野聚光器、荧光显微镜光源、恒温调节器、照相机、摄影机等。5.可根据不同观察目的选用不同的相差物镜：正反差物镜、PL物镜、PLL物镜、NH物镜。培养的CHO细胞 中国仓鼠卵巢细胞中国仓鼠卵巢细胞1.用相差显微镜观察细胞应注意瓶（或皿）的厚度、均匀性、清洁度、气温等。2.天气较冷时，若与显微镜观察处温

4、差较大，由于温差使培养瓶内壁形成雾滴而影响观察的清晰度，此时可轻轻将瓶倾斜使瓶内培养液浸润内壁培养液浸润内壁，以得到好的相差像。3.若对原代细胞培养进行相差显微照相，最好选择换选择换液液后进行。（三）相差显微镜观察活细胞的注意事项细胞生长状况有关指标的检测方法 1. 细胞计数 （四）、 培养细胞的观察利用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的方法。Cell counting using a haemocytometer 计算四角大方格计算四角大方格内的细胞数；内的细胞数；每个方格容积为每个方格容积为110-4ml细胞数/ML4大格细胞总数/410000稀释倍数1毫

5、米计数原则：不数死计数原则：不数死细胞（染蓝）、压细胞（染蓝）、压线细胞数上不数下，线细胞数上不数下，数左不数右，一团数左不数右，一团细胞按一个计数！细胞按一个计数！ 1毫升毫升1立方厘米立方厘米 三、培养细胞的检测指标 2.细胞生长曲线：观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标；培养时间d为横坐标，细胞密度为纵坐标作坐标图。条件：具备自身稳定生长特性。 生长曲线是培养细胞生物学特性的基本参数之一，是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标。 常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响！ 细胞生长曲线 3. 细胞分裂指数 细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度增殖旺盛程度的指标。它

6、以被测1000个细胞中的分裂细胞数来计算。 测定方法：用秋水仙素秋水仙素将细胞处理12小时后，按染色体制片法染色体制片法制片制片并染色，计算1000个细胞中分裂相的数目，重复4次取平均值，用百分比表示。 分裂指数=分裂细胞数/总细胞数100% 4. 细胞贴壁率 细胞贴壁率又称细细胞接种存活率胞接种存活率。 它是细胞被制成分散的悬液后，以低密度(25个细胞/cm2)被接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群(克隆)的细胞百分数值，用以表示细胞的生存能力和细胞群的活力。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的

7、细胞。 克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。 由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。5. 细胞周期 一个细胞分裂生长周期时间；与细胞群体倍增时间的区别（对数生长期内细胞数量增加一倍所用的时间）。标记有丝分裂百分率法（percentage labeledmitoses，PLM）： 对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。放射标记物为3H或者14C标记的TdR。 G1：DNA合成

8、前期合成前期S：DNA合成期合成期G2：DNA合成后期合成后期M：有丝：有丝分裂期分裂期 6. MTT法测定细胞活力 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝 四唑盐比色法的原理：活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲臜（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。 活细胞率 =（细胞总数-死细胞数）/ 细胞总数 x 100%三、细胞培养中常用的染色方法（一）活体

9、染色在体外条件下用某种染色剂对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞生命活动的方法。活体染料：碱性活体染料+酸性活体染料常用碱性活体染料，使用浓度较低，0.005%、0.01%、0.1%、0.2%，采用平衡盐溶液、PBS、生理盐水配制。 用0.5%浓度的台盼蓝（Trypan blue）,用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞死细胞着色（蓝色），可测定活细胞数和计算存活百分率。 （二）染料排除检测法荧光染料染色观察 2.溴化乙锭（溴化乙锭（EB）和碘化丙啶（）和碘化丙啶（PI）染色）染色嵌入核酸双链之间，只能标记死死细胞！ （红色荧光）3.Acridine Orange（AO）丫啶橙直接染色观

10、察活细胞，同时标记DNA和RNADNA：亮绿色荧光RNA：橘红色-红色荧光 吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭仅能透过胞膜受损的细胞胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。 凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。 在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态： 活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构； 早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状； 非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构； 晚期凋亡细胞(NVA)

11、，核染色质为橘红色呈固缩状或圆珠状。1污染及途径：细胞培养中，与培养无关的杂质的混入培养系统统称为污染。 空气：最主要途径，消毒不严格，季节、净化工作台故障、湿度、温度、周边环境等。 器材清洗消毒不彻底 操作：基本功不扎实、不认真、不规范、交叉污染、器具消毒不严格等。 血清：制备水平低，支原体或病毒污染。 组织 样本四、细胞培养的污染和检测最严峻的挑战最严峻的挑战-污染污染(contamination) 细胞培养的污染问题十分重要，一旦发细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立要建立无菌观念无菌观念。遇到培养污染要

12、分析原因，。遇到培养污染要分析原因，及时处理。及时处理。 培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回，培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回，加入抗生素也基本无能为力。特别是霉菌和细加入抗生素也基本无能为力。特别是霉菌和细菌。菌。 1.细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染：酸碱度酸碱度发生异常的改变。b. 培养液出现混浊。混浊。c. 光镜观察到菌丝和颗粒菌丝和颗粒。d. 细胞出现死亡或增殖缓慢死亡或增殖缓慢等 2.细菌污染：常见革兰氏阴性菌（白色葡萄球菌） 、大肠杆菌、假单胞菌。现象：初期变化不明显，后期培养液浑浊，镜下可见菌体。预防：青霉素和链

13、霉素可预防。3.真菌污染 ：常见烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。特点：大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面；镜下呈丝状、管状或树枝状，纵横交错，散在细胞周边和细胞之间。抗真菌制剂可预防和排除真菌污染。4.支原体污染：介于细菌和病毒之间，能独立生活的最小微生物。最常见、不易察觉；大小介于0.2-2 m，约1%可通过滤菌器 对酸耐受性差，对热较敏感，青霉素无效 。“正常”感觉 。支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰变，干扰DNA的

14、复制，以及具有类病毒作用。在培的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。往往被忽略。 支原体检测方法和处理1）荧光技术检测：支原体含有DNA，能与一种荧光染料Hoechest 33258特异性的结合，可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体。2）直接培养法：实验室常用。3）放射自显影检测：4）DNA分子杂交及PCR法5）电镜检测法6）3H-胸腺嘧啶掺入法在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。 萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。 支原体污染细胞的Hoechst33258染色结果 支原体污染电镜照片（30K） 5.病毒的污染及检测： 借助宿主细胞进行复制装配成新的病毒颗粒或整合到宿主DNA上进行复制。1）致细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）或集落的检测：采用相差显微镜检测