暑期分子生物学奥赛理论培训

1、暑期分子生物学奥赛理论培训DNA复制的一般特征复制的一般特征n以原来的DNA两条链作为模板，四种dNTP为前体，还需要Mg2n作为模板的DNA需要解链n半保留复制n需要引物主要是RNA，少数是蛋白质 n复制的方向始终是53 n具有固定的起点 n多为双向复制，少数为单向复制 n半不连续性 n具有高度的忠实性和进行性 DNA复制可能的三种方式复制可能的三种方式在复制叉中不连续合成的DNA片段称为冈崎片段，连续合成的DNA子链被称为前导链，不连续合成的DNA子链被称为后随链或滞后链。 参与参与DNA复制的主要酶复制的主要酶和蛋白质的结构与功能和蛋白质的结构与功能nDNA聚合酶nDNA解链酶n单链结合

2、蛋白nDNA引发酶nDNA拓扑异构酶nDNA连接酶n端聚酶（真核生物特有） DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的全名是依赖于DNA的DNA聚合酶，就是以DNA为模板，催化DNA合成的聚合酶。DNA聚合酶是参与DNA复制的主要酶，该酶的许多性质直接决定了DNA复制的一些基本特征。DNA聚合酶聚合酶反应通式： Mg2+ DNA + 引物-OH + dNTP DNA/引物-dNMP + PPi 5 3 随后的随后的 PPi迅速水解驱动反应的进行迅速水解驱动反应的进行细菌DNA 聚合酶 DNA pol I,II,III,IV和V真核生物DNA 聚合酶 DNA pol ,和以及更多已在大肠杆菌中发现已在大肠

3、杆菌中发现5种不同的种不同的DNA聚合酶聚合酶 nDNAP I: 切除引物和修复nDNAP II: 在DNA修复中起作用nDNAP III: 主要的DNA复制酶 nDNAP IV: 在DNA修复中起作用1.DNAP V:在DNA修复中起作用DNA聚合酶家族聚合酶家族真核细胞的真核细胞的DNA聚合酶聚合酶已在真核细胞中发现至少15种以上的DNA聚合酶，除了5种发现较早的DNA聚合酶、和以外，其它几种DNA聚合酶如聚合酶、和都有相关的报道，这些新发现的DNA聚合酶一般缺乏3-外切酶的活性（除外），因此没有校对的功能，它们主要参与DNA的跨越合成，以克服损伤对DNA复制的不利影响。 端聚酶的结构与功

4、能端聚酶的结构与功能端聚酶也称为端粒酶，由蛋白质和RNA两种成分组成，其中蛋白质具有逆转录酶的活性，其三维结构与其它逆转录酶有明显的相似性，而RNA含有拷贝的端粒DNA重复序列，这一部分序列作为逆转录酶的模板。不同来源的端聚酶在RNA长度上变化很大，但它们都形成特定的二级结构，作为模板的那一部分序列处于单链状态，以方便它与端粒区的重复序列结合，并有效地充当逆转录的模板。几种真核生物的端粒重复序列几种真核生物的端粒重复序列物种名称重复序列四膜虫、草履虫和纤毛虫T2G4酵母(TG)13TG23拟南芥T3AG3人T2AG3端聚酶的结构模型端聚酶的结构模型 端聚酶的作用机理端聚酶的作用机理 端粒酶活性

5、与细胞分裂能力的关系端粒酶活性与细胞分裂能力的关系 细菌与真核细胞的细菌与真核细胞的DNA复制比较复制比较真核细胞的DNA复制在很多方面与细菌极为相似，但也有几点不同于细菌的地方：（1）需要解决核小体和染色质结构对DNA复制构成的障碍；（2）复制叉移动的速度远低于细菌；（3）具有多个复制子，这可以弥补复制叉移动速度低对整个DNA复制速度的制约；（4）冈崎片段的长度小于细菌；（5）复制被限制在细胞周期的S期，并受到严格的调控；（6）在第一轮复制结束之前不能进行第二轮复制，细菌在第一轮复制还没结束的时候就可以进行第二轮复制；（7）需要端聚酶解决染色体DNA末端复制问题（8）复制终止没有特定的像大肠

6、杆菌Ter序列的终止区。 古菌的古菌的DNA复制复制在DNA复制上，古菌与细菌相似的是，它也不需要也没有端聚酶，因为其染色体DNA是环状，无端粒结构，而在其他方面更像真核生物，主要表现在：DNA模板与组蛋白形成核小体，而核小体结构对复制会产生一定影响；许多古菌具有多个复制起始区；参与复制的许多蛋白质和酶在结构与功能上非常接近真核生物。DNA复制的高度忠实性复制的高度忠实性C四种dNTPs浓度的平衡CDNA聚合酶的高度选择性CDNA聚合酶的自我校对C错配修复C使用RNA作为引物绝绝 句句复错不要紧，只要校对真，错了我一个，还有后来酶。DNA的损伤DNA的修复直接修复切除修复损伤跨越DNA的突变突

7、变的类型与后果突变的原因回复突变与突变的校正二、二、DNA的损伤、修复和突变的损伤、修复和突变哪些因素能影响到哪些因素能影响到DNA的完整性？的完整性？N细胞内源的因素N环境因素 -例如化学试剂、污染物和UVN疾病治疗-例如离子辐射和化疗细胞内源因素细胞内源因素N复制错误- 例如四种dNTP量的不平衡导致错配NDNA本身的不稳定- 碱基的自发脱氨基- DNA的脱嘌呤/脱嘧啶导致碱基脱落N活性氧的作用- DNA, 蛋白质和脂质的氧化环境（外源）因素环境（外源）因素N化学试剂化学试剂 (1) 天然化合物 黄曲霉素 (2) 人造化合物 苯并芘- 香烟 顺铂- 化疗药物N物理因素物理因素 (1) UV

8、 (2) 离子辐射 -射线 x-射线DNA损伤类型损伤类型N碱基修饰N碱基丢失-无碱基位点N复制错误：错误 N链断裂N蛋白质-DNA交联NDNA-DNA交联DNA损伤的因素和损伤的主要类型损伤的因素和损伤的主要类型损伤类型实例/原因碱基丢失自发脱碱基（热、酸），脱嘌呤脱嘧啶，104嘌呤脱落/天/细胞（恒温动物）碱基修饰形成碱基加合物，例如，8-羟基脱氧鸟嘌呤（离子辐射或活性氧），6-烷基鸟嘌呤（烷基化试剂）碱基交联嘧啶二聚体和6-4光产物（UV）碱基转换CU，AI（自发脱氨基），100碱基脱氨基/天/细胞碱基错配GT（4种dNTP浓度不平衡、碱基的互变异构或碱基之间的差别不足）DNA链断裂因磷

9、酸二酯键被破坏引起单链断裂或双链断裂（离子辐射或特殊的化学试剂），因脱氧核糖环3号位发生断裂引起的DNA链断裂（博来霉素）DNA链间交联互补双链之间产生交联（双功能试剂的作用）DNA与蛋白质的交联UV紫外线引起的碱基损伤紫外线引起的碱基损伤 DNA 修复修复DNA是唯一一种在发生损伤以后可以被完全修复的分子，而其他生物大分子在受到损伤以后要么被降解，要么被取代。当然，并不是发生在DNA分子上的所有损伤都能修复。如果受到的损伤不能及时被修复，可导致细胞的癌变和早衰。细胞之所以在DNA受到损伤以后，选择的处理方法是尽量将其修复而不是将其降解，这一是因为作为遗传物质的DNA分子在细胞内只有一个拷贝，

10、如果将其水解的话，细胞也就失去了存在的根基；二是DNA的互补双螺旋结构使得修复一个受损伤的DNA分子变得很容易。直接修复直接修复嘧啶二聚体的直接修复由DNA光裂合酶催化。此酶直接识别和结合嘧啶二聚体。然后，利用辅基捕捉到的光能，将嘧啶二聚体打开，最后再与DNA解离。但是胎盘类哺乳动物却没有这种酶。烷基化碱基的直接修复由特定的烷基转移酶催化 DNA链断裂的直接修复由DNA连接酶催化。 嘧啶二聚体的直接修复嘧啶二聚体的直接修复 烷基化碱基的直接修复烷基化碱基的直接修复 切除修复切除修复切除修复先切除损伤的碱基或核苷酸，然后，重新合成正常的核苷酸，最后，再经连接酶重新连接，将原来的切口缝合。整个切除

11、修复过程包括识别、切除、重新合成和重新连接。切除修复又分为碱基切除修复（BER）和核苷酸切除修复（NER），两者的主要差别在于识别损伤的机制上，前者是直接识别具体的受损伤的碱基，而后者并不识别具体的损伤，而是识别损伤对DNA双螺旋结构造成的扭曲。损伤跨越损伤跨越 重组跨越使用同源重组的方法将DNA模板进行交换以避免损伤对复制的抑制，从而使复制能够继续下去，而随后的复制仍然使用细胞内高保真的聚合酶，因此忠实性并无下降，故此途径被视为一种无错的系统。跨越合成又称为跨损伤合成，由专门的DNA聚合酶与停留在损伤位点上的原来催化复制的DNA聚合酶交换，在子链上（模板链上损伤碱基的对面）插入正确或错误的核

12、苷酸，结果导致对损伤位点无错或易错的跨越。 SOS反应反应是指细胞在受到潜在致死性压力下，例如UV辐射、胸腺嘧啶饥饿、DNA修饰物的作用和DNA复制所必需的基因的失活，做出的有利于细胞生存的代谢预警反应，包括易错的跨损伤合成、细胞丝状化和切除修复的激活，其中涉及到近20个“sos”基因的表达。 DNA的突变的突变L修复系统的不完善，为DNA的突变打开了方便之门，因为这些损伤如果在下一轮DNA复制之前还没有被修复的话，就有可能直接被固定下来传给子代，有的则通过易错的跨损伤合成产生新的错误并最终也被固定下来。这些发生在DNA分子上可遗传的结构变化通称为突变 突变的类型突变的类型L点突变是指DNA

13、分子某一位点上所发生的一种碱基对变成另外一种碱基对的突变，可分为转换和颠换两种形式，其中，转换是指两种嘌呤碱基或两种嘧啶碱基之间的相互转变，颠换是指嘌呤碱基和嘧啶碱基之间的互变 L移码突变是指在一个蛋白质基因的编码区发生的一个或多个核苷酸（非3的整数倍）的缺失或插入。 碱基突变的几种方式碱基突变的几种方式 点突变的后果点突变的后果L突变的密码子决定同样的氨基酸，这样的突变对蛋白质的结构和功能不会产生任何影响，因此称为沉默突变。L突变的密码子决定不同的氨基酸，这样的突变可能对蛋白质的功能不产生任何影响或影响微乎其微，也可能产生灾难性的后果而带来分子病。由于突变导致出现了错误的氨基酸，因此，这样的

14、突变称为错义突变。如果错误的氨基酸与原来的氨基酸是同种性质，这种突变被称为中性突变。L突变的密码子变为终止密码子或者相反，前者因为终止密码子的提前出现可导致一条多肽链被截短，被称为无义突变，后者则会加长一条多肽链，被称为加长突变或通读突变。 隐性突变和显性突变隐性突变和显性突变LDNA突变可能是隐性的，也可能是显性的。L如果突变仅仅是灭活一种蛋白质，那么，这种突变一般产生隐性性状。L如果突变产生的蛋白质对细胞有毒，这种毒性无法被另外一条染色体上正常基因表达出来的正常的蛋白质所抵消或中和，那么，这种突变被视为显性。突变的原因突变的原因几乎任何导致DNA损伤的因素都能够导致DNA突变，前提是它们造

15、成的损伤在DNA复制之前还没有被细胞内的修复系统修复，因此，可以这样认为，导致DNA损伤的原因在某种意义上就是导致DNA突变的原因。由内在因素引起的突变被称为自发性突变，由外在因素引发的突变被称为诱发突变。各种导致DNA突变的内外因素总称为突变原。导致自发点突变的原因导致自发点突变的原因$自发的点突变（1）DNA复制过程中的错配（2）自发脱氨基 （3）活性氧的氧化（4）碱基的烷基化 $自发的移码突变（1）“复制打滑” （2）转座作用。 自发脱氨基和活性氧作用引起的碱基转换自发脱氨基和活性氧作用引起的碱基转换 诱发突变诱发突变诱发点突变 碱基类似物，如5-溴尿嘧啶和2-氨基 嘌呤 烷基化试剂，如

16、氮芥和硫芥等 脱氨基试剂，如亚硝酸 羟胺 诱发移码突变 -嵌入试剂，如吖啶黄，原黄素和EB等 诱变剂诱发的点突变诱变剂诱发的点突变 三、三、DNA转录转录中心法则DNA转录的一般特征依赖DNA的RNA聚合酶启动子细菌与真核生物的DNA转录比较古菌的DNA转录中心法则中心法则-“一个中心（DNA），两个基本点（RNA和蛋白质”DNA 转录与转录与DNA复制的比较复制的比较与DNA复制的共同性质 1) 需要模板、Mg2、解链和解除转录过程中形成的正超螺旋 2) 只能按照53的方向进行与DNA复制不同的性质 1)不需要引物 2) NTPs 代替dNTPs; UTP代谢dTTP 3) 缺乏校对活性（错

17、误率在1/104 1/105 nts） 4) 发生在特定的区域（不是所有的DNA序列） 5) 对于一个特定的基因而言，只有一条链转录 记住一些名称模板链（无意义链，Watson链）和编码链（有意义链，Crick链）编码链，有意义链，编码链，有意义链， Crick 链链模板链，无意义链，模板链，无意义链， Watson 链链转录转录翻译翻译RNA聚合酶聚合酶*共同的性质 -DNA模板：一条链被转录 -底物：GTP, CTP, UTP, ATP -二价金属离子：Mg2+ *与DNA聚合酶之间的主要差别 细菌细菌RNA聚合酶的结构与功能聚合酶的结构与功能C 所有的三类RNA由同一种RNA聚合酶催化*

18、 全酶* 核心酶：2 , 1 , 1 , 1 * 抑制剂：利福霉素和利链霉素真核细胞的真核细胞的RNA聚合酶聚合酶真核细胞的RNA聚合酶出现了功能分工，不同性质的RNA由不同的RNA聚合酶催化转录，其细胞核具有三种RNA聚合酶，即RNA聚合酶I、II、和III，三者也分别被称为RNA聚合酶A、B和C，它们分别催化细胞核内的rRNA（5S rRNA除外）、mRNA（大多数microRNA和小RNA（tRNA和5SrRNA）的转录。除此以外，线粒体和叶绿体也含有RNA聚合酶。 RNA聚合酶聚合酶 II 抑制剂抑制剂N 白毒伞含有有毒的环状十肽鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱E这种蘑菇口味不错，但却是致命的！E 食

19、用6 24小时之后，开始出现强筋挛和腹泻E第3天出现假恢复E第4或第5天，死亡随时发生，除非进行肝移植细菌启动子的性质细菌启动子的性质 * 启动子通常由转录起始点上游40bp长的序列组成* 包括两段一致序列： “-35 区区” 一致序列是TTGACA Pribnow盒或盒或“-10 区区”一致序列是TATAAT* “35”区区和“10区区”之间的间隔序序列的性质不重要，但长度重要，一般为171bp。* “增效元件增效元件”发现在某些转录活性超强的rRNA基因的上游40和60之间的区域，富含AT的启动子序列，可将转录活性提高30倍。* 如果一个基因的启动子序列与一致序列越相近，则该启动子的效率就

20、越高，为强启动子；反之，就是一个弱启动子。细菌和真核生物在转录上的差别细菌和真核生物在转录上的差别 $染色质和核小体结构对转录有深刻的影响$真核细胞RNA聚合酶高度分工$转录还需要许多被称为转录因子的蛋白质的参与$启动子以外的序列参与调节基因的转录$转录与翻译不存在偶联关系$转录的产物多为单顺反子，而原核基因的转录产物多为多顺反子各种顺式作用元件各种顺式作用元件*增强子*沉默子*绝缘子*应答元件古菌的古菌的DNA 转录转录与复制系统相比，古菌似乎拥有简版的真核转录系统。无论是催化转录的RNA 聚合酶的结构和性质，还是启动子的结构以及转录的基本过程都与真核生物极为相似。然而，在基因表达的调控方面

21、，古菌与细菌接近。在启动子的结构上，古菌类似于真核生物由RNA 聚合酶所负责转录的基因，一般由三个部分组成：一是位于转录起点上游的TATA 盒，它由TBP 识别；二是位于TATA 盒上游的BRE，它由TFB 识别；三是位于转录起点的起始子元件（Inr）四、转录后加工四、转录后加工核苷酸修饰：碱基修饰和核糖修饰剪切剪接：顺式剪接、反式剪接和选择性剪接（可变剪接）添加核苷酸：加帽和加尾编辑细菌细菌mRNA前体的后加工前体的后加工在细菌，mRNA很少有后加工。但某些噬菌体mRNA会发生最简单的剪切反应，将一个多顺反子切割成单顺反子，也有某些噬菌体的mRNA需要经过相对复杂的剪接反应才能成熟（如T4噬

22、菌体编码的胸苷酸合酶）。真核细胞真核细胞mRNA前体的后加工前体的后加工*加工形式 1) 5-端 = 加帽 2) 3-端 = 加尾 3) 内部 = 剪接 4) 内部=甲基化 5) 编码区=编辑*后加工机制加帽和甲基化加帽和甲基化 *帽子结构*加帽反应：共转录*功能mRNA前体的剪接前体的剪接剪接这种后加工方式是在发现基因断裂的现象后确定的。1977年，由Phillip Sharp和Richard Roberts领导两个实验小组几乎同时在腺病毒的晚期表达基因中发现蛋白质基因断裂现象。进一步研究表明，基因断裂是真核细胞及其病毒的基因组中的普遍现象，在高等生物的基因组中，只有很少的蛋白质基因是连续的

23、（如组蛋白和干扰素），但在低等的真核生物，断裂基因却不多见。不同断裂基因含有的内含子数目不一定相同，同样内含子大小也会有差别。一般说来，一个典型的真核生物蛋白质的基因由10% 的外显子序列和90%的内含子序列组成。 mRNA前体的剪接机制前体的剪接机制 *mRNA前体的剪接是高度精确的。其精确性一方面取决于位于外显子和内含子交界处的剪接信号（可以将其视为内因），另外一方面取决于5种被称为snRNP的核糖核酸蛋白质复合物（可以将其视为外因）。*剪接反应的“内因”剪接信号*剪接反应的“外因”snRNP和剪接因子*剪接反应两次转酯反应rRNA前体的后加工前体的后加工*细菌-剪切、修剪和修饰*真核生物

24、 1)剪切、修剪和修饰 （需要snoRNA） 2)剪接 （某些真核生物，如四膜虫）tRNA前体的后加工前体的后加工*细菌 1) 剪切和修剪 2) 修饰 3) 添加CCA (如何需要)*真核生物 1) 剪切和修剪 2) 修饰 3) 添加CCA 4) 剪接(某些真核生物)参与翻译的主要生物大分子翻译的一般特征细菌与真核生物的蛋白质合成比较翻译的抑制剂核糖体的分类与组成核糖体的分类与组成 核糖体的主要功能定位核糖体的主要功能定位nA部位氨酰tRNA结合部位，也称为受体部位；nP部位肽酰tRNA结合部位；nE部位空载tRNA临时结合的部位；n肽酰转移酶活性部位催化肽键形成的部位，其本质是核酶；nmRN

25、A结合部位；n多肽链离开通道正在延伸的多肽链离开核糖体的通道；n一些可溶性蛋白质因子（起始因子、延伸因子和终止因子）的结合部位。核糖体的三维结构模型和主要的功能部位核糖体的三维结构模型和主要的功能部位真核细胞多聚核糖体的结构真核细胞多聚核糖体的结构细菌多顺反子细菌多顺反子mRNA和真核生物单顺反子和真核生物单顺反子mRNA的翻译的翻译 辅助蛋白因子辅助蛋白因子蛋白质合成的每一步都需要一些特殊的可溶性的蛋白质因子的参与，包括起始因子（IF）、延伸因子（EF）、释放因子（RF）和核糖体循环因子（RRF），它们分别参与肽链合成的起始、延伸、肽链释放和核糖体循环。其中的某些蛋白质因子为小G蛋白。 蛋白

26、质生物合成的一般特征蛋白质生物合成的一般特征nmRNA、tRNA和核糖体起相同的作用n翻译的极性：阅读mRNA的方向都是从5端3端，多肽链生长的方向总是从N-端C-端。n三联体密码 n正确的氨基酸的参入取决于mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子之间的相互作用，与tRNA所携带的氨基酸无关 n密码子与反密码子的相互识别遵守摆动规则标准的遗传密码表标准的遗传密码表 遗传密码的主要性质遗传密码的主要性质n简并与兼职n密码子的选定不是随机的n通用和例外n不重叠n无标点n同一种氨基酸的不同密码子使用的频率不尽相同摆动规则摆动规则该规则的内容是：密码子在与反密码子之间进行碱基配对的时候，前两对碱基严格

27、遵守标准的碱基配对规则，第三对碱基则具有一定的自由度。但并非任何碱基之间都可以配对，当反密码子第一位碱基是A或C者，只能识别一种密码子；第一位碱基是G或U者，则能识别两种密码子；第一位碱基是I者，则能识别三种密码子。摆动规则的意义在于使得在翻译的过程中，tRNA和mRNA更容易分离。摆动规则摆动规则反密码子第一个碱基密码子第三个碱基ACGUIUGC、UA、GA、C、U起始密码子的识别起始密码子的识别细菌翻译系统起始密码子的识别主要是依赖于mRNA 5端的SD序列与16S rRNA3端的反SD序列之间的互补配对。SD序列位于起始密码子上游约7个碱基的区域，由45个碱基组成，富含嘌呤碱基，它是由J

28、ohn Shine和Lynn Dalgarno在1974年，通过比较多种原核细胞蛋白质mRNA的5端核苷酸序列之后总结出来的。在16S rRNA 3端有一段富含嘧啶碱基的序列，可以和SD序列互补配对，因而被称为反SD序列。许多实验证明，正是SD序列与反SD序列的互补关系，才使得位于mRNA 的SD序列下游的第一个AUG用作起始密码子。 SD序列和反序列和反SD序列序列多肽链合成的延伸多肽链合成的延伸每添加一个氨基酸需要三步反应进位、转肽和移位，每参入一个氨基酸需要消耗4个GTP 三步反应循环多次，循环的次数取决于mRNA上的密码子的数目 原核生物和真核生物在延伸循环上非常相似 快：15-20个

29、氨基酸/秒 精确：每参入10 000氨基酸出现1个错误真核生物的细胞质翻译系真核生物的细胞质翻译系统与细菌翻译系统的差别统与细菌翻译系统的差别n核糖体的沉降系数为80S，比原核系统大；nmRNA模板的结构差别很大，通常是单顺反子，有帽子和尾巴，但没有SD序列；n转录和翻译在时空上分离，分别发生在细胞核和细胞质，两者不存在偶联关系；n起始tRNA不进行甲酰化，也不能进行甲酰化；n只能使用AUG为起始密码子，而且识别起始密码子的机制也完全不同（核糖体扫描机制）；n起始阶段不仅消耗GTP，还消耗ATP；n起始因子的种类和结构更为复杂；n肽链延伸的速度低于细菌，大概是每秒钟参入2个氨基酸；n只有2种释

30、放因子；n对抑制剂的敏感性不同。古菌的翻译系统古菌的翻译系统古菌的翻译与真核生物也十分相似。这表现在以下几个方面：（1）核糖体大小与细菌一样，但构成核糖体的rRNA和蛋白质与真核生物的亲缘关系更密切。（2）参与翻译各个阶段的辅助蛋白质因子的数目以及结构的同源性接近真核生物，但各种因子的组成倾向于由单个亚基组成，而不像真核生物由多个亚基组成。在翻译终止阶段，细菌需要RRF，但古菌和真核生物都不需要RRF。（3）第一个参入的氨基酸和真核生物一样，都是甲硫氨酸，而不是细菌的甲酰甲硫氨酸。（4）对抑制剂，特别是对抗生素的敏感性相似。然而，古菌的翻译系统与细菌也有某些特征很相似。例如：没有5.8S rRNA，mRNA无帽子结构，多为多顺反子，有SD序列，翻译与转录是偶联的。 翻译的抑制剂翻译的抑制剂细菌翻译系统的抑制剂：大多数