第十二章遗传工程幻灯片讲义

1、第十二章遗传工程幻灯片讲义本章教学时数：本章教学时数：2 2学时。学时。本章重点：基因工程的基本流程。本章重点：基因工程的基本流程。本章难点：分子标记和基因图谱；本章难点：分子标记和基因图谱； 研究基因功能的方法研究基因功能的方法 1 1 遗传遗传工程概述工程概述 遗传工程：遗传工程： 细胞工程细胞工程 酶工程酶工程 发酵工程发酵工程 基因工程基因工程遗传工程的概念遗传工程的概念 遗传工程遗传工程 （genetic engineeringgenetic engineering），），也称生物工程（也称生物工程（biological biological engineeringengineeri

2、ng）。）。 是指利用工程技术的方法改造和修饰生是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或更适合人类物体，使其产生新的性状或更适合人类需求的产品的遗传学手段。需求的产品的遗传学手段。广义遗传工程和狭义遗传工程：广义遗传工程和狭义遗传工程：广义：包括细胞工程、基因工程、酶工程广义：包括细胞工程、基因工程、酶工程和发酵工程等。和发酵工程等。狭义：基因工程。狭义：基因工程。 细胞工程 在离体（在离体（in vitroin vitro）条件下以细胞为基本单位，条件下以细胞为基本单位，借助人工培养基，对生物细胞进行培养、繁殖，借助人工培养基，对生物细胞进行培养、繁殖，或者使其发生变异，从

3、而改良生物品种、创造或者使其发生变异，从而改良生物品种、创造新品种、加速繁育，或利用细胞培养生产有用新品种、加速繁育，或利用细胞培养生产有用物质的过程。物质的过程。 细胞工程包括细胞培养、细胞融合、细胞器转细胞工程包括细胞培养、细胞融合、细胞器转移、生物体的克隆与规模化繁殖等。移、生物体的克隆与规模化繁殖等。第一个哺乳动物的克隆Dolly羊酶工程酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品。将相应的原料转化成所需要的产品。是酶学理论与化工技术相结合的新技术体系。是酶学理论与化工技术相结合的新技术体系。发酵工程发酵工程 利用

4、微生物与现代化工程技术相结合，利用微生物与现代化工程技术相结合，工厂化生产人类需要的物质的一种技术工厂化生产人类需要的物质的一种技术体系。体系。 目前医用抗生素、农用抗生素绝大部分目前医用抗生素、农用抗生素绝大部分都是发酵工程产品。都是发酵工程产品。基因工程基因工程利用人工方法在体外（利用人工方法在体外（in vitroin vitro）切割、切割、拼接、重组生物的遗传物质，获得重组拼接、重组生物的遗传物质，获得重组DNADNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改良。受体的遗传特性得到修饰或改良。基因工程操作的对象是基因工程操作的对象是DN

5、ADNA分子。分子。又称为重组又称为重组DNADNA技术技术重组重组DNADNA技术流程技术流程 基因工程的工具酶基因工程的工具酶内切核酸酶内切核酸酶( (endonuclease)endonuclease)DNADNA连接酶连接酶( (ligase)ligase)DNADNA聚合酶（聚合酶（DNA polymeraseDNA polymerase）RNARNA聚合酶（聚合酶（RNA polymeraseRNA polymerase）反转录酶（反转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptase）最重要的工具酶是限制性核酸内切酶最重要的工具酶是限制性核

6、酸内切酶（restriction endonucleaserestriction endonuclease）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶或称限制性酶或称限制性酶( (restriction enzyme),restriction enzyme),是基是基因工程最重要的工具。因工程最重要的工具。在细菌中这些酶的功能是降解外来在细菌中这些酶的功能是降解外来DNADNA分子，分子，以限制以限制( (restriction)restriction)或阻止病毒侵染。或阻止病毒侵染。这类酶能识别双链这类酶能识别双链DNADNA分子中特异的核苷酸分子中特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连序列，并在特定

7、的位置将双连DNADNA分子切断。分子切断。 Eco R 限制性内切核酸酶的命名原则限制性内切核酸酶的命名原则：根据分离出这种酶的细菌在分类学上的属名、根据分离出这种酶的细菌在分类学上的属名、种名和菌株名来命名。种名和菌株名来命名。名称的第一个字母是该细菌的属名的第一个字名称的第一个字母是该细菌的属名的第一个字母，大写，斜体。母，大写，斜体。名称的第二、三个字母是该细菌种名的前两个名称的第二、三个字母是该细菌种名的前两个字母，小写，斜体。字母，小写，斜体。名称的第四个字母是菌株的名称，大写或小写，名称的第四个字母是菌株的名称，大写或小写，正体。如果没有菌株名称就不写。正体。如果没有菌株名称就不

8、写。名称最后的是罗马数字，表示从这种细菌中分名称最后的是罗马数字，表示从这种细菌中分离出来的酶的序号，如从某个菌株中分离出来离出来的酶的序号，如从某个菌株中分离出来的第一种酶为的第一种酶为，第二种酶为，第二种酶为，等等。，等等。如如EcoEcoRR来自大肠杆菌（来自大肠杆菌（Escherichia Escherichia colicoli）R R菌株，读作菌株，读作echo-r-oneecho-r-one；HinHind d 来自流感噬血杆菌来自流感噬血杆菌 （Hemophilus influenzaeHemophilus influenzae）d d菌株菌株, ,读作读作hind-three

9、 hind-three 限制酶的分类限制酶的分类限制性核酸内切酶的工作分为限制性核酸内切酶的工作分为2 2个步骤：个步骤： 识别特定的识别特定的DNADNA序列序列 在特定的位置切割在特定的位置切割DNADNA分子分子根据其作用特点根据其作用特点, ,可以将限制性酶分为三种类型：可以将限制性酶分为三种类型： 型型 型型 型。型。在基因工程中用途最广泛的是在基因工程中用途最广泛的是型限制酶。型限制酶。型限制酶型限制酶有特定的识别序列有特定的识别序列但切割位置远离识别位置但切割位置远离识别位置有的种类可以在同识别序列相距有的种类可以在同识别序列相距10001000bpbp的位置的位置上随机切割上随

10、机切割DNADNA分子分子在基因工程中没有什么用途在基因工程中没有什么用途型限制酶型限制酶有特定的识别序列有特定的识别序列切割位置在识别序列切割位置在识别序列3 3端相距端相距2020bpbp处，处，可以产生各种类型的单链末端。可以产生各种类型的单链末端。型限制酶在基因工程中有特定的用途，型限制酶在基因工程中有特定的用途，但总体来说，用途不大。但总体来说，用途不大。型限制酶型限制酶在在DNADNA上有特定的识别序列上有特定的识别序列而且其切割位点就在识别序列内部而且其切割位点就在识别序列内部基因工程中用途最广基因工程中用途最广识别序列是对称的，在一条链中从识别序列是对称的，在一条链中从5 5到

11、到3 3方方向的序列与其互补链从向的序列与其互补链从5 5到到3 3方向的序列完方向的序列完全相同，称为回纹对称序列全相同，称为回纹对称序列( (palindrome)palindrome)。 酶切与连接酶切与连接常常见见内内切切酶酶DNADNA连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA ligase) 共价连接共价连接5 5磷酸和磷酸和3 3OHOH，形成磷酸二形成磷酸二酯键酯键( (3 3 5 5phosphodiester bond)phosphodiester bond) ，封，封闭闭DNADNA双链上的缺刻双链上的缺刻(nick)(nick)。反转录酶反转录酶reverse rev

12、erse transcriptasetranscriptase 3 3 载体载体( (vector)vector)将外源将外源DNADNA片段运送进宿主细胞片段运送进宿主细胞( (host host cell)cell)进行扩增或表达的运载工具称进行扩增或表达的运载工具称为载体为载体。载体也是载体也是DNADNA分子。分子。常用载体：常用载体： 细菌质粒、噬菌体、病毒等。细菌质粒、噬菌体、病毒等。 都要经过人工改造。都要经过人工改造。 细菌人工染色体（细菌人工染色体（BACBAC） 酵母菌人工染色体（酵母菌人工染色体（YACYAC） 人类人工染色体（人类人工染色体（HACHAC）载体的基本条件

13、载体的基本条件有独立的复制原点有独立的复制原点( (ori)ori)，能独立地自我能独立地自我复制，而且能带动外源复制，而且能带动外源DNADNA一起复制。一起复制。具有多种限制性酶的切点，用于连接外源具有多种限制性酶的切点，用于连接外源DNA DNA 片段。片段。载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个。制酶来说只能有一个。具有一个选择标记基因。具有一个选择标记基因。质粒载体质粒载体分子量小分子量小(2.69(2.69kb),kb),但能携带较大的外源片段；拷贝数多但能携带较大的外源片段；拷贝数多, ,在每个宿主细胞在每个宿主细胞可达可达50

14、0500个；酶切位点多，克隆方便；具有个；酶切位点多，克隆方便；具有-互补显色表型互补显色表型, ,便于检测。便于检测。 互补显色反应互补显色反应 噬菌体（噬菌体（3030kbkb） 粘粒（粘粒（cosmidcosmid）载体（）载体（4545kbkb）细菌人工染色体细菌人工染色体BACBAC（300kb300kb）bacterial artificial chromosomebacterial artificial chromosome来源于来源于F F因子因子YAC（1Mb）yeast artificial chromosomeyeast artificial chromosomeTiTi

15、质粒质粒TiTi质粒是根癌农杆菌的染色体外遗传物质质粒是根癌农杆菌的染色体外遗传物质双链闭合环状双链闭合环状DNADNA，150150200kb200kb植物基因工程常用的载体植物基因工程常用的载体TiTi质粒结构质粒结构T-DNAT-DNA Transfer DNA Transfer DNA是农杆菌侵入植是农杆菌侵入植物细胞时从物细胞时从TiTi质质粒上转移到植物粒上转移到植物细胞的一段细胞的一段DNADNAT-DNAT-DNA两端个有两端个有一段一段2525bpbp的同向的同向重复序列，是重复序列，是T-T-DNADNA的边缘区的边缘区LBLB；RBRB在同一条单链的在同一条单链的LBLB

16、和和RBRB内各形成内各形成一个缺口，单链一个缺口，单链T-DNAT-DNA进入植物进入植物细胞细胞4 4 基因的分离与鉴定基因的分离与鉴定 从基因库中分离基因从基因库中分离基因 聚合酶链式反应聚合酶链式反应( (PCR)PCR)扩增基因扩增基因人工合成基因人工合成基因T TDNADNA标签法标签法 ( (一一) )从基因库中分离基因从基因库中分离基因 1 1构建基因库构建基因库 2 2筛选基因库筛选基因库 3 3阳性克隆的分析与鉴定阳性克隆的分析与鉴定 1 1构建基因库构建基因库 基因库基因库 ( (library)library)是一组是一组DNADNA或或cDNAcDNA序列序列克隆的集

17、合体。克隆的集合体。 创建基因文库的目的是从特定的材料中创建基因文库的目的是从特定的材料中分离目的分离目的DNADNA片段或基因。片段或基因。把所有的基因集中在一个库中，采用一把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方法在库中筛选目的基因。定的方法在库中筛选目的基因。同时也便于基因的长期保存。同时也便于基因的长期保存。基因组文库基因组文库 Genomic DNA libraryGenomic DNA library使用与切割载体相同的限制酶，将供体使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组生物的基因组DNADNA切割成许多片段切割成许多片段将所有片段连接到载体上，构成一个重将所有片段连接到载

18、体上，构成一个重组组DNADNA群体群体这个群体包含全基因组的遗传信息这个群体包含全基因组的遗传信息cDNAcDNA文库文库 cDNA library cDNA library 以以mRNAmRNA为模板，经反转录酶合成互补为模板，经反转录酶合成互补DNA(complementary DNADNA(complementary DNA，cDNA)cDNA) 将双链将双链cDNAcDNA与适当载体连接与适当载体连接 转化到宿主细胞内进行扩增，建成转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNAcDNA文库文库 基因组文库与基因组文库与 cDNA cDNA文库的比较：文库的比较：基因组文库包含基因组的所有基因

19、基因组文库包含基因组的所有基因 cDNA cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列组织、或某一发育时期的表达序列 分离特定基因，分离特定基因，cDNAcDNA库比较方便库比较方便研究调控序列，必须基因组文库研究调控序列，必须基因组文库从基因库中筛选特定的克隆从基因库中筛选特定的克隆 一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底在哪个克隆上呢？在哪个克隆上呢？ 根据待选基因相关信息根据待选基因相关信息 确定筛选方法和条件。确定筛选方法和条件。 最常用的方法是利用一段核苷酸序列作探针最常用的方法是利用

20、一段核苷酸序列作探针，用用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，筛选放射性同位素或非放射性同位素标记探针，筛选基因库基因库 DNA探针（探针（probe） 探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列 DNA DNA、cDNAcDNA、寡聚核苷酸寡聚核苷酸 单链、双链单链、双链 同位素标记、荧光标记、颜色标记同位素标记、荧光标记、颜色标记筛选文库筛选文库质粒基因库筛选质粒基因库筛选细菌混合液在培细菌混合液在培养在平板上养在平板上转移到尼龙膜上转移到尼龙膜上裂解细菌裂解细菌变性变性DNADNA标记探针标记探针杂交杂交漂洗漂洗放射自显影或荧放射自显影或荧光检

21、测光检测挑取对应菌落、挑取对应菌落、培养培养抽提质粒抽提质粒 阳性克隆的分析与鉴定阳性克隆的分析与鉴定 u 从基因库中筛选出的阳性克隆，还需从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因基因 u 测序测序 自动测序仪自动测序仪u 功能分析功能分析 预测软件预测软件核酸序列测定的原理核酸序列测定的原理磷酸二脂键磷酸二脂键测测序序电电泳泳图图谱谱核酸序列分析与功能预测核酸序列分析与功能预测 同源性比较同源性比较 同源基因是指那些起源相同、序列相似同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因。的基因。 可从核酸及蛋白质两种水平比较基因间可从核酸及

22、蛋白质两种水平比较基因间的同源性。的同源性。 将测出的核酸序列同杂交的探针序列进将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较行比较 将得到的序列发到将得到的序列发到BLASTBLAST等等DNA DataDNA Data库的库的网址上比较网址上比较开放阅读框（开放阅读框（open reading frame, ORFopen reading frame, ORF）分析分析开放阅读框：一段能编码一条多肽链，并具有开放阅读框：一段能编码一条多肽链，并具有翻译起始信号（翻译起始信号（ATGATG）和终止信号和终止信号 ( (TAATAA、TAGTAG或或TGA)TGA)的核苷酸序列。的核苷酸序列。来自来

23、自cDNAcDNA库的序列可直接进行库的序列可直接进行0 0RFRF分析，比较分析，比较其与其他序列的同源性来确定其身份。其与其他序列的同源性来确定其身份。来自核基因库的序列，因大多数真核生物基因来自核基因库的序列，因大多数真核生物基因含有内含子。含有内含子。开放阅读框（开放阅读框（open reading frame, ORFopen reading frame, ORF）分析分析 TGCTCGCTCCTACGAATCCTGCCCCTGAGTAACAATGACTGACTTTTAATTTGTTTGCAG 61 CTAGGGTGGGGATCGAGATGGTGATCTTGGAGCAGCCACAGC

24、TGCTCCTTCTTCTTCTTC121 TTCTTGTAGCAGCTGCAGCTGCAACCGGCGCCACAGCAGCCGACGACGAGTTGGAGTGTC181 CCTCCTCCATCTTCGGTAAGTAGCAAAGCACAGTATGACATTCACGAATGCATGTCATGA241 TCTATCACTCCCTTTGTCTTCGCTACATTACATACTCTGCCTGTGTTTACCTACTGTACC301 CGTCTTCAATTCAATTTGCTGTTGGCTCCCGCGCTTTCCCGAAGCCGCGTGTAGTAGTAT361 CATAAAAGTAGGAGTAGATCTT

25、TAATTTGCCCGGCGAAAACTGCTCCTAGTGGTAGATCT421 TTGGCTCGGATCGGAGAAGATATTGTAGCTGTACTCTGATCGAGAGCATGCATGCTTGTT481 AATCCGATCGAGCGTATTCCTCTGAGTTTGTTATGCTCTGATATTGTAATTGTGGCTGGA541 TAATTTTCAAGAAAAAAAAATCGGTTACATACATGCATTTGCACTAATTAACTAGATTGT601 GCATCAACAGATCACGCTGTGAACTCTCAAGGCGCCATTCAGTTCCCCGTGTTCCACAAG661 AA

26、GCACCAATGCCTCCGCCCATGGTCTGTCCGTGCAACCCAGGCATCCTCGACCGGAGCA721 TCAGGAGCAGGAAAAGGAGGAGGATTGAACAATCTACAGGAAGAGGAGATCACTTCATCA781 AGTAGTACAAAAATCGACGTGATCGAAGACAGCAGCATCAACGACTTCCTGTTCCTAATG841 GCCGTCAGTCTGGGCAAGCCACCGGTTGTGAACCTGGTGGCGATCGACACGGGATCCACC901 CTCTCGTGGGTGCAATGCCAGCCGTGCGCGGTGCACTGCCACACGC

27、AGTCCGCGAAGGCC961 GGCCCGATATTCGATCCCGGCAGATCCTACACATCCCGGCGAGTTCGCTGCTCGTCGGTC1021 AAGTGCGGCGAGCTGAGGTACGATCTGCGGCTCCAGCAAGCCAATTGCATGGAGAAGGAA1081 GACAGCTGCACGTACAGCGTCACGTACGGGAACGGGTGGGCGTACAGCGTGGGCAAGATG1141 GTGACAGACACGCTGAGGATTGGGGACTCGTTTATGGATCTCATGTTCGGGTGCAGCATG1201 GATGTCAAGTACAGCGAATTCG

28、AGGCCGGCATCTTTGGTTTCGGCAGCAGCAGCTTCTCT1261 TTCTTCGAGCAGCTGGCAGGGTACCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCATTAAGCTACTGC1321 TTGCCCACTGACGAGACCAAGCCCGGATACATGATCCTGGGAAGATACGACCGTGCCGCC1381 ATGGATGGGGGTTACACTCCTCTCTTCCGGTCAATCAACAGGCCAACCTACTCACTGACG1441 ATGGAGATGCTTATCGCCAACGGGCAGAGATTGGTGACATCGTCTTCGGAGATGATCGTC15

29、01 GATTCCGGGGCCCAGAGGACGTCCCTGTGGCCTTCCACTTTTGCTCTCCTTGACAAGACC1561 ATCACGCAGGCAATGTCGTCGATTGGGTATCACCGGACATCAAGAGCGCGCCAAGAATCA1621 TACATCTGCTACTTATCGGAGCACGACTATTCTGGTTGGAACGGCACCATCACGCCCTTC1681 TCCAACTGGTCCGCCTTGCCTCTGCTGGAGATCGGCTTCGCCGGCGGTGCTGCACTCGCT1741 TTGCCACCCAGAAACGTCTTCTACAACGATCCACACC

30、GCGGTTTGTGCATGACCTTTGCT1801 CAGAATCCTGCTCTCAGGTCTCAGATACTGGGGAACAGGGTTACTCGATCCTTCGGAACA1861 ACCTTCGACATCCAGGGGAAACAATTCGGCTTCAAATATGCCGTTTGCTGATCGTCGATT1921 ATTCCTCATCCTATGATATCTTATAGCTTGCGGGTACGTACCAAGTATATATCAAACTAA1981 TTGCATACATGCTCTCCCTCCCTCTGTCCATGCATGTCCTCGTTTCATTGCAAATCTGCA2041 TCGATCAATCCA

31、GTTACTGATAATTCCTCCTTATTAACTTAGGCTGATCGATCCATTGCT2101 TCTCGTGTGTATATTATGCAGGTCGATTAATTAGCTGGTTTGCCCAAATAACTGATCGGA2161 TTGGAGTCTTCTCCCGCGCTACACTACCCCTAGCTGCGATCGTATCACAAGCTAGCGGTA2221 CTTGATTTGGGACCTAATTCGTTCAAAAAAAACTTGGCAGCTTAATTTGGGACCTAGTAG2281CTAGCTGAGCCACTACTAGATGTTTACGTACCAGCTATCCGTCGTTTGTTTGT

32、GTCTCCT2341 GTGCTTGTGCT 2351bp( (二二) )聚合酶链式反应聚合酶链式反应( (PCR)PCR)扩增基因扩增基因 利用利用PCRPCR方法可以在数小时内使目的方法可以在数小时内使目的DNADNA片段扩增到数百万个拷贝。片段扩增到数百万个拷贝。 基本原理：基本原理： 根据待扩增基因的部分序列合成成对引根据待扩增基因的部分序列合成成对引物，在体外合成两个引物之间的物，在体外合成两个引物之间的DNADNA序列。序列。聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCRPCR，polymerase chain reactionpolymerase chain reaction)PCRPC

33、R反应反应根据待扩增基因序列合成两个引物，根据待扩增基因序列合成两个引物，10-2010-20bp,bp,分别分别与待扩增基因二条链的两端互补。与待扩增基因二条链的两端互补。在在DNADNA模板变性成单链后，两个引物分别与单链模板变性成单链后，两个引物分别与单链DNADNA复性，在耐热的复性，在耐热的Taq polymerseTaq polymerse及及4 4种脱氧核苷酸存种脱氧核苷酸存在下，由引物引导合成在下，由引物引导合成DNADNA新链。新链。3 3个步骤：个步骤： 变性变性 94-95, 94-95,双链变性成单链双链变性成单链 复性复性 50-70, 50-70,两个引物分别与单链

34、两个引物分别与单链DNADNA互补互补 延伸延伸 72, 72,在引物在引物TaqTaq酶的作用下从酶的作用下从5353的方的方向合成模板向合成模板DNADNA的互补链。的互补链。 PCRPCR反应常有反应常有25253535个循环个循环经过经过2525个循环以后，理论上原来一个分个循环以后，理论上原来一个分子子DNADNA可以扩增为可以扩增为10106 6个拷贝。个拷贝。仅用少量的模板仅用少量的模板DNADNA分子，可以得到大量分子，可以得到大量扩增产物。扩增产物。通常可以扩增通常可以扩增5 5kbkb左右的左右的DNADNA片段。片段。性能更好的性能更好的TaqTaq酶可以扩增长达酶可以扩

35、增长达4040kbkb的的DNADNA片段。片段。PCRPCR扩增的扩增的DNADNA序列经过核酸序列测定分序列经过核酸序列测定分析后，可作为基因工程的目的基因。析后，可作为基因工程的目的基因。PCRPCR循环数与产物拷贝数之间的关系循环数与产物拷贝数之间的关系循环数循环数1 12 21 12 25 52 25 5323210102 210101024102415152 21515327683276820202 22020104857610485761101106 625252 2252533554432335544323103107 730302 2303010737418241073741

36、8241101109 9PCR产物拷贝数PCR产物拷贝数PCRPCR技术的关键技术的关键 人工合成寡核苷酸片段（引物）人工合成寡核苷酸片段（引物） 耐热的耐热的Taq DNA polymerase （来自（来自Thermus aquaticus，94kDa）PCRPCR方法已成为分子生物学研究常规手段方法已成为分子生物学研究常规手段而且还用于遗传、发育、进化、疾病诊而且还用于遗传、发育、进化、疾病诊断、法医学等领域断、法医学等领域PCRPCR技术的发明是现代生物学发展史上的技术的发明是现代生物学发展史上的又一个里程碑又一个里程碑发明人获得了发明人获得了19931993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学

37、奖 （三）（三） 人工合成基因人工合成基因根据已知的基因序列，或根据氨基酸序根据已知的基因序列，或根据氨基酸序列推测列推测DNADNA序列序列将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNADNA的方法结合起来，可以很快地人工合的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。成基因。首先化学合成多个含有首先化学合成多个含有8080100100个核苷酸的寡聚个核苷酸的寡聚核苷酸核苷酸每个寡聚核苷酸片段之间有每个寡聚核苷酸片段之间有19192424个核苷酸的个核苷酸的重叠序列重叠序列再将各个寡聚核苷酸等量再将各个寡聚核苷酸等量( (摩尔浓度摩尔浓度) )混合，在混合，在DNADN

38、A聚合酶聚合酶 ( (或或TaqTaq酶酶) )作用下，各寡聚核苷酸又作用下，各寡聚核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链。作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链。再用两个再用两个PCRPCR引物，经引物，经PCRPCR扩增出扩增出DNADNA片段。若将片段。若将两个两个DNADNA片段放在一起，经片段放在一起，经SOE-PCR(sequence SOE-PCR(sequence overlapped extensionoverlapped extension，SOE)SOE)扩增出完整的基扩增出完整的基因片段因片段（四）（四） T TDNADNA标签克隆基因标签克隆基因 利用利用

39、T TDNADNA插入创造突变体插入创造突变体 获得突变体的纯合材料获得突变体的纯合材料 分析突变体性状与分析突变体性状与T TDNADNA的共分离关系的共分离关系 PCR PCR获得获得T TDNADNA的侧翼基因组序列的侧翼基因组序列 用所得序列作探针筛选基因文库，获得用所得序列作探针筛选基因文库，获得目标基因或克隆目标基因或克隆 再作进一步的分析再作进一步的分析T TDNADNA标签克隆基因的基本原理标签克隆基因的基本原理构建构建T TDNADNA载体载体转化植物（转化植物（T1T1，T TDNADNA杂合体）杂合体）筛选筛选T2T2，获得突变体获得突变体寻找与寻找与T TDNADNA共

40、分离的个体共分离的个体让其自交，产生纯合体让其自交，产生纯合体PCRPCR获得获得T TDNADNA两侧的基因组序列两侧的基因组序列利用侧翼利用侧翼DNADNA序列作探针从序列作探针从DNADNA文库中钓取基因文库中钓取基因基因功能验证基因功能验证（遗传互补测验，用分离的野生基因转化突变体，恢复功能）（遗传互补测验，用分离的野生基因转化突变体，恢复功能）重组重组DNADNA分子的构建分子的构建v 用相同的内切酶酶解目的基因与载体用相同的内切酶酶解目的基因与载体v 将载体与目的基因混合将载体与目的基因混合v 用用DNA ligaseDNA ligase连接连接重组重组DNADNA分子的构建分子的

41、构建5 5 外源基因导入宿主细胞外源基因导入宿主细胞v 将目的基因与载体连接，构建重组将目的基因与载体连接，构建重组DNADNA分子分子v 重组重组DNADNA分子必须导入宿主细胞才能扩分子必须导入宿主细胞才能扩增或表达增或表达重组重组DNADNA导入原核生物导入原核生物v 原核生物基因工程的受体通常是大肠杆菌原核生物基因工程的受体通常是大肠杆菌v 导入方式多用转化法导入方式多用转化法v 也有用结合的方法也有用结合的方法重组重组DNADNA导入植物导入植物1 1、根癌农杆菌转化技术、根癌农杆菌转化技术2 2、基因枪法、基因枪法根癌农杆菌转化技术根癌农杆菌转化技术根癌农杆菌根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens)根癌农杆菌介导的植物转化是应用得最根癌农杆菌介导的植物转化是应用得最早而广泛的一种植物转化方法。早而广泛的一种植物转化方法。双子叶植物、单子叶植物都可以用。双子叶植物、单子叶植物都可以用。将目的基因与花椰菜花叶病毒将目的基因与花椰菜花叶病毒3535S S启动子启动子及终止子组成嵌合及终止子组成嵌合DNADNA分子分子插入到插入到TiTi衍生质粒的衍生质粒的RBRB与与LBLB之间构成重之间构成重组质粒组质粒转化根瘤土壤杆菌细胞转化根瘤土壤杆菌细胞重组根瘤土壤杆菌感染植物细胞重组根瘤土