第十教学单元——第三章病毒(一)

1、病病 毒毒病毒和我们的关系病毒和我们的关系“Virus”，它是由，它是由拉丁文中拉丁文中“virus”一词演化而来，一词演化而来，即即“有毒的物质有毒的物质”1886年，年，A. Mayer 发现具有传染性的烟草花叶病；发现具有传染性的烟草花叶病；1892年，年，D. Ivanovsky烟草花叶病病原体能通过细菌滤器：烟草花叶病病原体能通过细菌滤器： 一种能通过细菌滤器的一种能通过细菌滤器的“细菌毒素细菌毒素”或或“极小细极小细菌菌”1898年，年，M W Beijerinck对烟草花叶病病原体的研究结果：对烟草花叶病病原体的研究结果：1884年年Chamberland发明细菌滤器发明细菌滤器

2、1900年前后，包括口蹄疫（年前后，包括口蹄疫（foot and mouth disease）在内的）在内的多种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明。多种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明。F W Twort（1915年）、年）、F dHerelle（1917年），分别发现年），分别发现细菌（细菌（Shigella dysenteriae）病毒）病毒-噬菌体噬菌体1935年，年，W M Stanley首次提纯并结晶了烟草花叶病毒；首次提纯并结晶了烟草花叶病毒； Bawden等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；1940年，年，Kausche首先用电镜观察到烟草花叶病

3、毒颗粒首先用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒.1952年，年，Hershey和和Chase利用同位素证实噬菌体的遗传物利用同位素证实噬菌体的遗传物质是质是DNA，将人类带入病毒的分子生物学阶段。，将人类带入病毒的分子生物学阶段。 宿主细胞在病毒等多种诱生剂刺激下产生的一组相对分子宿主细胞在病毒等多种诱生剂刺激下产生的一组相对分子量低的糖蛋白，具有抗病毒和免疫调节功能。分量低的糖蛋白，具有抗病毒和免疫调节功能。分 、三组，分别由白细胞、成纤维细胞和三组，分别由白细胞、成纤维细胞和T淋巴细胞产生。淋巴细胞产生。 、属属型干扰素，型干扰素，属属型干扰素。型干扰素。四、病毒的培养和纯化四、病毒的培养和纯化

4、将少量噬菌体与将少量噬菌体与大量宿主细胞混合后，大量宿主细胞混合后，在合适条件下培养一在合适条件下培养一定时间后，在平板表定时间后，在平板表面布满宿主细胞的菌面布满宿主细胞的菌苔上，出现一个个肉苔上，出现一个个肉眼可见的透明小圆斑。眼可见的透明小圆斑。（ “负菌落负菌落” ） 设设0.10mL稀释度为稀释度为10-6的病毒悬液可产生的病毒悬液可产生75个噬菌斑，则样品的噬菌斑形成单位为：个噬菌斑，则样品的噬菌斑形成单位为：PFU/mL=（75 PFU /0.10 mL ）（106）=7.5 108若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在

5、培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑（蚀斑（plaque）或称空斑。）或称空斑。 在某些感染病毒的宿主细胞质或细胞核内，出现光学在某些感染病毒的宿主细胞质或细胞核内，出现光学显微镜下可见的大小、形状和数量不等的小体。显微镜下可见的大小、形状和数量不等的小体。（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）差速离心、梯度离心（超速离心）差速离心、梯度离心（超速离心） 个体小（测量单位个体小（测量单位nm），必需在电镜下观察；），必需在电镜下观察；基本构造：核衣壳基本构造：

6、核衣壳(nucleocapsid)非基本构造非基本构造DNA或或RNA核心核心衣壳衣壳包膜包膜刺突刺突螺旋对称衣壳病毒：烟草花叶病毒螺旋对称衣壳病毒：烟草花叶病毒 病毒可以根据衣壳中衣壳粒的排列方式将其分为病毒可以根据衣壳中衣壳粒的排列方式将其分为3 3种：种：二十面体对称衣壳病毒：腺病毒二十面体对称衣壳病毒：腺病毒复合对称衣壳病毒：复合对称衣壳病毒：T4T4噬菌体噬菌体 壳体外形如中空的蛋白质圆壳体外形如中空的蛋白质圆管，呈坚硬或柔韧状。管，呈坚硬或柔韧状。 由由2130个个相同的蛋白质亚基相同的蛋白质亚基（158个氨基酸）个氨基酸）以逆时针方以逆时针方向螺旋状排列，形成一个长向螺旋状排列，

7、形成一个长300nm，内径，内径4nm，外径，外径15nm的刚直中空柱。的刚直中空柱。ssRNA盘绕在盘绕在壳体内面由亚基形成的沟内，壳体内面由亚基形成的沟内，与蛋白质亚基通过弱键结合。与蛋白质亚基通过弱键结合。螺旋对称壳体病毒螺旋对称壳体病毒代表：代表：TMV流感病毒流感病毒衣壳有衣壳有20个等边三角形面，个等边三角形面，12个顶角。个顶角。包括包括12个五邻体（分布在个五邻体（分布在12个顶角上的个顶角上的衣壳粒）和衣壳粒）和240个六邻体（分布在棱上和个六邻体（分布在棱上和面上的非顶角衣壳粒）。核心为线状双面上的非顶角衣壳粒）。核心为线状双链链DNA(dsDNA)，核酸分子以高度卷曲，核

8、酸分子以高度卷曲的状态存在于衣壳内。的状态存在于衣壳内。 五邻体五邻体六邻体六邻体二十面体衣壳在形成时通常是由五边形二十面体衣壳在形成时通常是由五边形衣壳粒（五邻体）和六边形衣壳粒（六衣壳粒（五邻体）和六边形衣壳粒（六邻体）组成的邻体）组成的（参见（参见P74） 其壳体由头部和尾部组成。通常头部呈二十面体对称，尾其壳体由头部和尾部组成。通常头部呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。线状部呈螺旋对称。线状dsDNA折叠盘绕于头部的核心。折叠盘绕于头部的核心。代表：大肠杆菌的代表：大肠杆菌的T偶数噬菌体偶数噬菌体头头尾髓尾髓颈环颈环尾鞘尾鞘尾丝尾丝刺突刺突基板基板1、 病毒的核酸病毒的核酸病毒基因组大小

9、差别很大病毒基因组大小差别很大 最小的基因组（最小的基因组（MS2病毒，病毒，QB病毒）只有病毒）只有1 106 Da，仅够编码，仅够编码34种蛋白质，这些病毒利用重叠基因来节省空种蛋白质，这些病毒利用重叠基因来节省空间。最大的基因组（间。最大的基因组（T偶数噬菌体，疱疹病毒，痘病毒）达偶数噬菌体，疱疹病毒，痘病毒）达1.6 108 Da，可编码，可编码100多种蛋白质。多种蛋白质。单链单链DNA（ss DNA）；）；双链双链DNA（ds DNA）；）；单链单链RNA（ss RNA）；）；双链双链RNA（ds RNA）4种类型种类型(1) DNA病毒病毒 特殊的碱基：除常见核苷酸外，许多病毒具

10、有特殊的碱基，特殊的碱基：除常见核苷酸外，许多病毒具有特殊的碱基，如，大肠杆菌如，大肠杆菌T偶数噬菌体以偶数噬菌体以5-羟甲基胞嘧啶羟甲基胞嘧啶代替胞嘧啶。代替胞嘧啶。 (2) RNA病毒病毒 2、病毒的蛋白质、病毒的蛋白质3、病毒的其它化学成分、病毒的其它化学成分 （一）双链（一）双链DNA噬菌体的复制噬菌体的复制1. 一步生长实验一步生长实验 病毒的滴度（病毒的滴度（titer），又称效价，是指每毫升样品中），又称效价，是指每毫升样品中含有的侵染性病毒粒子的数量。含有的侵染性病毒粒子的数量。(双层平板法测双层平板法测)潜伏期：是从噬菌潜伏期：是从噬菌体吸附于宿主细胞体吸附于宿主细胞表面到子

11、代噬菌体表面到子代噬菌体释放所需的最短时释放所需的最短时间间裂解量：是每个受裂解量：是每个受侵染的细胞所产生侵染的细胞所产生的子代噬菌体的数的子代噬菌体的数目。目。 2. 噬菌体的复制过程（烈性噬菌体的裂解周期）噬菌体的复制过程（烈性噬菌体的裂解周期） 受体（吸附）位受体（吸附）位点：细胞壁上的点：细胞壁上的脂多糖、蛋白质、脂多糖、蛋白质、磷壁酸，以及鞭磷壁酸，以及鞭毛和菌毛毛和菌毛附着附着 固着固着 尾部收缩尾部收缩 刺入细胞刺入细胞 DNA注入注入T4噬菌体吸附和侵入宿主细胞过程：噬菌体吸附和侵入宿主细胞过程：如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多如果大量噬菌体在短时间

12、内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多小孔，也可引起细胞立即裂解，但并未进行噬菌体的增殖，这种现小孔，也可引起细胞立即裂解，但并未进行噬菌体的增殖，这种现象称为象称为自外裂解自外裂解（lysis from without）。）。早期早期mRNA ：宿主：宿主RNA聚合酶开始合成的病毒聚合酶开始合成的病毒mRNA，即噬，即噬菌体菌体DNA复制前转录的复制前转录的mRNA。早期蛋白：早期早期蛋白：早期mRNA翻译成的蛋白，这些蛋白将接管宿主翻译成的蛋白，这些蛋白将接管宿主细胞并合成病毒核酸。其中一些酶将宿主细胞并合成病毒核酸。其中一些酶将宿主DNA降降解成核苷酸，为病毒解成核苷酸，为病毒DNA的合成

13、提供原料；一些的合成提供原料；一些蛋白对宿主细胞蛋白对宿主细胞RNA聚合酶进行修饰，使其识别聚合酶进行修饰，使其识别病毒的病毒的DNA启动子，开始转录合成中期启动子，开始转录合成中期mRNA。中期中期mRNA：即病毒：即病毒DNA复制所需的酶的复制所需的酶的mRNA。 噬菌体噬菌体DNADNA注入宿主细胞后，宿主细胞自身的注入宿主细胞后，宿主细胞自身的DNADNA、RNARNA和蛋白质的合成便会中止，转而合成病毒复制所需的成分。和蛋白质的合成便会中止，转而合成病毒复制所需的成分。中期蛋白中期蛋白：中期中期mRNA翻译成的蛋白翻译成的蛋白(DNA复制所需的酶、羟复制所需的酶、羟甲基胞嘧啶合成酶以

14、及晚期甲基胞嘧啶合成酶以及晚期mRNA聚合酶等聚合酶等)，病，病毒毒DNA开始复制开始复制(某些碱基的修饰是抵制宿主的限某些碱基的修饰是抵制宿主的限制制)。 多联体多联体-合成的合成的T4噬菌体噬菌体DNA具有末端冗余具有末端冗余(重复的一重复的一段碱基序列段碱基序列)，大约，大约6-10个克隆通过末端冗余序列个克隆通过末端冗余序列连接在一起，这种由若干单元同向相连形成的超连接在一起，这种由若干单元同向相连形成的超长链长链DNA称为多联体，多联体在装配过程中被切称为多联体，多联体在装配过程中被切割。割。 晚期晚期mRNA： DNA复制完成后合成的复制完成后合成的mRNA(指导结构蛋白、指导结构

15、蛋白、装配蛋白、溶菌酶等装配蛋白、溶菌酶等)。晚期蛋白：噬菌体的结构蛋白、装配蛋白、溶菌酶等这些细晚期蛋白：噬菌体的结构蛋白、装配蛋白、溶菌酶等这些细胞裂解期间合成的蛋白质胞裂解期间合成的蛋白质。大致分为大致分为4个独立的途径：个独立的途径：1）头部壳体装入）头部壳体装入DNA形成形成成熟的头部成熟的头部2）由基板、尾管、尾鞘组）由基板、尾管、尾鞘组装成无尾丝的尾部；装成无尾丝的尾部；3）头部与尾部自发结合；）头部与尾部自发结合；4）装上尾丝）装上尾丝头部头部衣壳粒衣壳粒DNA衣壳衣壳尾部尾部尾鞘尾鞘噬菌体噬菌体尾丝尾丝 37培养时，侵染约培养时，侵染约22分钟后，分钟后，E. coli发生裂

16、解并发生裂解并释放约释放约300个个T4噬菌体。这一过程需要一些噬菌体。这一过程需要一些T4基因的支基因的支持：持： 一种基因指导溶菌酶的合成，溶菌酶可以攻击细胞一种基因指导溶菌酶的合成，溶菌酶可以攻击细胞壁的肽聚糖；壁的肽聚糖； 另一种噬菌体蛋白称为另一种噬菌体蛋白称为holin，它可破坏细胞膜，使，它可破坏细胞膜，使溶菌酶到达并破坏细胞壁，同时阻止细胞膜上的能量溶菌酶到达并破坏细胞壁，同时阻止细胞膜上的能量代谢反应。代谢反应。 （二）单链（二）单链DNA噬菌体的复制噬菌体的复制(1) X174噬菌体噬菌体DNA进入宿主细胞后，利用宿主进入宿主细胞后，利用宿主DNA聚聚合酶以单链合酶以单链D

17、NA为模板合成双链模式为模板合成双链模式(复制型复制型DNA或或RF DNA); (2)随后复制型随后复制型DNA将指导合成更多的将指导合成更多的RF DNA、mRNA和和+DNA基因组，基因组，mRNA翻译成病毒蛋白；翻译成病毒蛋白；(3)此类噬菌体的裂解和释放机制和此类噬菌体的裂解和释放机制和T4噬菌体基本相同。噬菌体基本相同。 E. coli噬菌体噬菌体X174的遗传物质是单链的遗传物质是单链DNA。其。其DNA序序列与病毒列与病毒mRNA相同，即为正链，其基因组中有重叠基相同，即为正链，其基因组中有重叠基因（因（overlapping genes）。）。复制过程复制过程1. X174复

18、制过程复制过程2. 丝状丝状ssDNA噬菌体噬菌体(如：如：fd噬菌体噬菌体)(1)丝状噬菌体通过附着丝状噬菌体通过附着于大肠杆菌性菌毛而侵于大肠杆菌性菌毛而侵染宿主细胞。染宿主细胞。(2)噬菌体噬菌体DNA在吸附蛋在吸附蛋白协助下沿着或通过菌白协助下沿着或通过菌毛注入宿主。毛注入宿主。(3)噬菌体噬菌体DNA首先合成首先合成复制型复制型DNA，然后进行，然后进行转录，噬菌体转录，噬菌体DNA以滚以滚环模式进行复制。环模式进行复制。丝状丝状ssDNA噬菌体单链噬菌体单链DNA为环形，位于衣壳中心。其复制为环形，位于衣壳中心。其复制过程不同于过程不同于X174噬菌体或其他噬菌体或其他ssDNA噬菌体。噬菌体。 A-蛋白蛋白细细胞胞壁壁细胞膜细胞膜衣壳蛋白衣壳蛋白噬菌体噬菌体ssDNA C-蛋白蛋白(4)子代颗粒的装配是在噬菌体子代颗粒的装配是在噬菌体DNA穿过宿主细胞外膜时完成穿过宿主细胞外膜时完成并分泌出来，