毕业论文(李颖)

1、学号：毕业设计（论文）题目：HCV核心区基因片段（C70-140）的原核表达作者：李颖 届别：2012届系别：化学化工学院专业：生物工程指导老师：聂东宋 职称：副教授完成时间：2012年5月20日摘要在大肠杆菌中表达HCV核心区基因片段（C70-140）, 构建一个pBVIL-70-140原核表达载体，用于丙型肝炎核心抗原(HCV-cAg)和丙型肝炎抗体(HCV-Ab)联合检测。通过逆转录PCR扩增HCV核心片段，RT-PCR 产物经XhoI和XbaI双酶切后连接到经同样酶切的pBVIL原核表达载体中, 转化大肠埃希氏菌BL21，并以IPTG 诱导蛋白表达，SDS-PAGE 鉴定。结果表明，将

2、目的基因与表达载体pBVIL进行连接，得原核表达载体pBVIL-70-140，该载体转化大肠埃希氏菌BL21后可诱导表达出分子量约为25 KD的重组蛋白。关键词：丙型肝炎病毒;核心区基因片段(C70-140)；原核表达AbstractThe objective is to express the recombinant HCV core gene fragment (C70-140)in Escherichia coli andbuild a pBVIL-70-140 prokaryotic expression vector forthe hepatitis B core antigen (

3、 HCV-cAg ) and hepatitis C antibodies ( HCV-Ab ) combined detection. HCV core fragmentwas amplified by RT-PCRand the product was digested by XhoI and XbaI, then the fragment was inserted into an Escherichia coli prokaryotic expression vector pBVIL，and used totransform E.coli BL21.The target protein

4、was expressed in BL21andinduced by IPTG，andthe expressed protein was indentified by SDS PAGE. We got the pBVIL-70-140 prokaryotic expression vector by connecting the purpose gene and expression vector pBVIL, the result showed that the pBVIL-70-140 prokaryotic expression vector can induce the express

5、ion of the recombinant protein molecular weight of about 25KD through the transformation of Escherichia coli.Key words:HCV;Core gene fragment(C70-140); Prokaryotic expression目录中文摘要英文摘要前言1一、材料与方法 31、材料31.1实验仪器 31.2实验酶及主要试剂31.3试剂盒 41.4分子量标准 41.5引物 41.6菌株和载体 41.7实验血浆 42、方法42.1主要溶液配制 42.2培养基配制 52.3丙型肝炎病

6、毒RNA提取 62.4引物设计 62.5逆转录成cDNA 62.6 PCR扩增目的基因 62.7载体质粒DNA与目的基因DNA的制备及酶切 72.8质粒大片段及目的基因片段的分离回收与纯化72.9目的基因片段与载体连接 82.10 BL21感受态细胞的制备82.11 转化92.12 重组克隆的筛选及鉴定 92.13 重组蛋白的表达与纯化 9二、结果 11 三、讨论 14参考文献 16致谢 18附录19前 言丙型肝炎病毒（HCV）是慢性肝炎和肝癌的主要病原体之一，感染HCV之后，约有5085的受染者成为慢性携带者；感染后20 年，约有20左右的感染者发生肝硬化；而一旦发展成为肝硬化，HCV 相关

7、的肝细胞癌每年的发生率为17；而且目前尚无有效的疫苗可以预防感染1-3。因而丙型肝炎给患者带来极大的健康负担和经济负担，已成为一个严重的社会和公共卫生问题。丙型肝炎呈全球性流行，平均HCV 感染率在3左右，全世界约有1.7 亿的HCV 感染者4，所感染的HCV 基因型主要包括9 种。我国一般人群的抗-HCV 阳性率为3.2，与世界平均水平接近，HCV 基因型以1b 和2a 为主，其中1b 型占到70以上5。HCV基因组是一个单股正链的RNA分子，HCV利用依赖于RNA的RNA聚合酶复制其基因组，在结构上可以分为三个区：5端的非翻译区（5-UTR，untranslated region），一个长

8、的多蛋白读码框（ORF），3端的非翻译区（3-UTR）6, 7。翻译区的多蛋白读码框可以翻译出多种结构蛋白（CORE, E1, E2,p7）和非结构蛋白(NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) 8, 9。HCV 的核心蛋白（CORE）不仅作为结构蛋白包裹病毒核酸、形成病毒的核衣壳10，而且可以通过多种途径11, 12抑制宿主对病毒感染的防御反应，参与细胞中的多条信号转导通路，调节细胞的生长周期等13。Li 等14在对HCV 自我调节机制的研究中发现，HCV 核心蛋白可以通过与HCV 内部核糖体进入位点（IRES）的结合，特异性的抑制IRES 型和帽依赖

9、型的翻译。所以，HCV 的核心蛋白可被看作一个多功能蛋白，能够影响多种细胞信号转导途径，激活多种病毒及细胞基因启动子，具有广泛的反式激活作用10；还可与宿主细胞中参与凋亡、转录调控、转化、膜重排及免疫逃逸等的调节分子发生相互作用11, 12, 15。目前，国内公众对丙肝流行现状缺乏全面准确的了解。据统计，在83的有丙肝高危险因素的人群中，仅有5检测过丙肝。并且对丙肝治疗尚未完全纳入医保，公众对丙肝认知水平也较低，调查过程中，约41的公众不知道丙肝。丙肝，市场上既没有非常明确的药物，也缺少有效的疫苗加以预防和阻止其进一步传播。因此，HCV的早期诊断对于筛查HCV的传染源、指导临床治疗和预后判断有

10、重大意义。当前，医疗机构主要通过对血清中抗HCV和HCV RNA的检测来筛查丙肝。但HCV感染后到抗HCV抗体的出现有一个平均为6周 12周的“窗口期” ,即使患者被高度感染，抗体检测技术也较难检测HCV的存在。所以抗HCV 不适合作为HCV 感染的早期诊断指标。而HCV RNA的检测方法虽然具有早期、敏感和特异等特点，但该方法在技术和设备上要求较高，费时，检出率低，难以在常规工作或基层实验室推广。针对上述检测中存在的一些不足之处，我们通过大肠杆菌中表达并纯化HCV 核心蛋白, 构建一个pBVIL-70-140原核表达载体,用于HCV抗体和HCV核心抗原的联合检测,使HCV感染的“窗口期”缩短

11、至2周，从而达到准确、快速、便捷的检测目的。一、材料与方法1、材料1.1实验仪器电子天平： AR3130，Ohaus Corp.Pine.Brank,NJ,USA恒温磁力搅拌器：HJ-3，金坛市富华仪器有限公司核酸蛋白检测仪：smartspec plus，BIO-RAD自动酶标洗板机：DEMIII型，北京拓普分析仪器有限公司酶标仪： MK3型，Thermo Labsystems MultiskanSSW型电热恒温水槽：上海博讯实业有限公司层析仪：BioLogic LP，BIO-RAD水平摇床：WD-9405B，北京六一仪器厂垂直电泳槽：DYCZ-24A，上海天能科技电泳仪：DYY-8B，北京六

12、一仪器厂水平电泳槽：DYCZ-40B，北京六一仪器厂凝胶成像系统： GEL DOC XR，BIO-RAD恒振荡器：THZ- C，太仓市实验设备厂水浴振荡器：HZS-H，哈尔滨东联电子技术开发有限公司高速冷冻离心机：CR21G，广州天美超声波细胞粉碎机：JY92-2D，宁波新芝生物科技离心机：114，SIGMA低温恒温水槽：NCB-1200，Tokyo Rikakikai CO.LTDPCR仪：2720，ABI超净工作台： 苏州净化设备厂1.2实验酶及主要试剂（1）Fermentas公司产品：限制性内切酶BamHI、XhoI、Tap酶，SUPERCRIPTTM、RiboLockTMRNase I

13、nhibitor。（2）Clontech公司产品：10×advantage 2×PCR Buffer 、50×dNTP mix 、Control DNA TemplatedNase、2× DNApolyme-rase mix、PCR-Grade Water。（3）OXOID产品：胰蛋白胨、酵母提取物。（4）Sigma产品：氨苄青霉素、Trizol、DEPC、Tris 、琼脂糖、IPTG、丙烯酸胺、甲叉双丙烯酞胺、TEMED、Na2CO3、NaHCO3、CaCl2。（5）HRP-兔抗人：北京博奥森产品。（6）聚苯乙烯酶联板：深圳金创华产品。（7）国产分析纯

14、：苯酚、氯仿、无水乙醇、异丙醇、甘油、氯化钠、琼脂、NaOH、NaAc、醋酸、溴化乙锭、HCl、EDTA、硼酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、醋酸钠、SDS。1.3试剂盒pMDTM18-T Kit购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自TaKaRa公司；胶回收纯化试剂盒购自TaKaRa公司；RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司；T4 DNA Ligase Kit购自Fermentas公司；DNA Ligation Kit Ver.2购自TaKaRa公司。1.4分子量标准核酸电泳分子量标准PUCMix18DNA Maker和蛋白

15、质电泳分子量标准蛋白Maker均购自Fermentas公司。1.5引物70-140-F：TATCTCGAGCGGCCCGAGGGCAGGAC70-140-R：TCGGTCTAGAGACGAGCGGTATGTACC由上海生物工程有限公司合成；1.6菌株和载体菌株：大肠杆菌BL21为湖南康润药业有限公司实验室保存。原核表达载体pBVIL：为湖南康润药业有限公司实验室保存。1.7实验血浆实验所用的HCV阳性血浆和阴性血浆，为湖南康润药业有限公司实验室提供。2、方法2.1主要溶液的配制（1）缓冲液A：50mM Tris-HCl(pH8.0pH9.0),2mM EDTA,100mM NaCl。（2）缓冲

16、液：50mM Tris-HCl(pH8.0pH9.0),2mM EDTA,100mM NaCl，0.5%Triton X-100(V/V)。（3）缓冲液：50mM Tris-HCl(pH8.0pH9.0),2mM EDTA,100mM NaCl，0.5%Triton X-100(V/V)，2M尿素。（4）缓冲液B：100mM Tris-HCl(pH8.0pH9.0),6M尿素。（5）10×TBE电泳缓冲液:108g Tris，55g硼酸，40ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0)，加水定容至1L，用前稀释10倍即成应用液。（6）TE缓冲液:10mmol/L Tris-Cl P

17、H8.0，1mmol/L EDTA PH8.0，用DEPC水配制。（7）0.1mol/LCaCl2:称取无水CaCl2 1.11g，加ddH2O定容至l00ml，0.22um滤器过滤除菌，4贮存。（8）50%甘油：10ml甘油加10mlddH2O，灭菌后4贮存。（9）l%琼脂糖凝胶:1g琼脂糖，100ml1×TBE，10ul溴化乙锭。（10）01 mol/L IPTG：于8mlddH2O中溶解0238g IPTG后，定容至10ml，022um滤纸过滤除菌，分装成lml，20贮存。（11）30%丙烯酞胺溶液：取丙烯酞胺29g，甲叉双丙烯酞胺1g，于37溶解完全后，定容至100ml，过滤

18、避光4保存。（12）10%过硫酸铵：取lg过硫酸铵，加ddH2O定容至10ml，4贮存。（13）10%SDS：取SDS10g，加入ddH2O 90ml，加热助溶，用5molHCl调PH至72，定容至100ml。（14）浓缩胶缓冲液(l0mol/LTrisCl PH68) ：:取Tris碱121g，加ddH2O80ml溶解，用5mol/L HCl调PH至68，定容至100ml，4贮存备用。（15）分离胶缓冲液(l5mol/LTrisCl PH88) ：取Tris碱1816g，加ddH2080ml溶解，用5mol/LHCl调PH至88，定容至100ml，4贮存备用。（16）5×Tris-

19、甘氨酸电泳缓冲液：取Tris碱151g，甘氨酸94g，SDS5g加ddH2O溶解，定容至1000ml，4贮存备用，用前稀释5倍即成应用液。（17）2×SDS样品缓冲液：一巯基乙醇lml，lmol/LTrisCl(PH68)ml，10%SDS4ml，甘油2ml，01%溴酚蓝，加ddH2O至10ml。（18）考马斯亮蓝R250染色液:考马斯亮蓝R2500.5g，甲醇90ml，冰乙酸2Oml，ddH2O90ml。（19）脱色液:甲醇180ml，冰乙酸40ml，加ddH2O至400ml。（20）1×PBS：140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4,1.

20、8mM KH2PO4 PH7.3。（21）Elution buffer: 50mM Tris-HCl,10mM reduced glutathione PH8.0。（22）1×PBST: 1×PBS 0.05%Tween-20 PH7.3。（23）包被液(碳酸盐缓冲液，PH9.6):取NaHCO32.93g，Na2CO31.59g，加ddH20定容至1000ml。（24）封闭液：2%BSA 1×PBS PH7.3。（25）底物 A: 磷酸盐-柠檬酸缓冲液(0.2mol/LNa2HPO4:25.7ml，0.lmol/L柠檬酸24.3ml，过氧化脲0.04%，ddH2

21、O50ml，PH5.O。（26）底物 B: 磷酸盐-柠檬酸缓冲液(0.2mol/LNa2HPO4:25.7ml，0.lmol/L柠檬酸24.3ml，TMB0.03%，ddH2O50ml，PH5.O。（27）终止液：112ml浓H2SO4ddH20定容至1000ml。2.2 培养基的配制 LB液体培养基：1%胰蛋白胨，05%酵母提取物，1%NaCI，用5mol/LNaOH调PH至70。LB固体培养基：在LB液体培养基中加入15%的琼脂。AmpLB液体培养基：在LB培养基中加入100ug/ml的氨苄青霉素。2.3丙型肝炎病毒RNA的提取2.3.1 取一支用DEPC水处理过的EP管，分别加入200u

22、l HCV抗原阳性血浆，再加入150ulTrizol，混匀后室温放置5min；2.3.2加入200ul氯仿，4条件下，12000 rpm离心15min； 取上清200ul，加入等量异丙醇，-20放置2个小时。2.3.4在4条件下，12000 rpm离心15min，弃上清液；2.3.5加入1ml 75%乙醇后5000 rpm离心5min，弃上清液自然风干；2.3.6 加入30ulDEPC处理水溶解备用。2.4引物设计 针对HCV基因序列，利用分析软件PRIMER PREMIER 5辅助设计了一对PCR引物，分别在5端和3端引入XhoI和XbaI酶切位点.2.5逆转录成cDNA 模板RNA 负链引

23、物 DEPC处理水混匀后70放置5min，再至冰上按顺序加入以下试剂5×reaction bufferRiboLockTMRNase Inhibitor（20u/ul）10mM dNTP mix混匀后37放置5min，加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase（200uul） 1ul简单离心后，放置在42 60min，再放置70 10min，冰浴。2.6 PCR扩增目的基因ddH2O37ul10xPCRbuffer5ul10mmol/LdNTP1ul25pmol/L正链引物2ul25pmol/L负链引物2ul模板2ul2U/ulTaqDNA聚

24、合酶1ul总体积50ul混匀后放入PCR仪反应，反应参数为：94变性10min，94 30s60 30s72 30s60 30s，共进行32个循环，最后72延伸10min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。2.7 载体质粒DNA与目的基因DNA的制备及酶切用质粒提取试剂盒（TaKaRa公司）提取少量质粒DNA 1.取3ml过夜菌液，12000r/min离心2分钟，弃上清； 2.用250ul的Solution 充分悬浮细菌沉淀； 3.加入250ul的Solution 轻轻上下翻转混合56次，使菌体充分裂解，形成透明溶液； 4.加入400ul的4预冷的Solution ，轻轻上下翻转混合56次

25、，室温静置2分钟； 5.12000r/min离心10分钟，取上清； 6.将试剂盒中的Spin Column 安置于Collection Tube上； 7.将上述操作5的上清液转移至Spin Column中，12000r/min离心1分钟，弃去滤液； 8.将500ul的Rinse A加入Spin Column中，12000r/min离心30秒，弃滤液； 9.将700ul的Rinse B加入Spin Column中，12000r/min离心30秒，弃滤液； 10.重复操作步骤9； 11.将Spin Column安置于新的1.5ml离心管上，Spin Column膜的中央处加入60ul的Elutio

26、n Buffer，静置1分钟； 12.12000rpm离心1分钟洗脱DNA。将提取的质粒用限制性内切酶进行双酶切：质粒64ul10×反应缓冲液8ul限制性内切酶限制性内切酶加水至80ul，轻轻混匀，37水浴酶切过夜， 15%琼脂糖凝胶电泳检测酶切情况。2.8 质粒大片段及目的基因片段的分离回收与纯化用冻融法从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。按常规方法对质粒和目的基因酶切反应后的样品进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切割目的条带，装入1.5mlEppendorf管中。后续步骤按按TaKaRa公司胶回收纯化试剂盒操作。其操作如下：1.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=

27、1ul进行计算。2.向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下表：3.均匀混合后75加热融化胶块（低浓度的琼脂糖凝胶只需在45加热）。此时应间断振荡混合。4.向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量一半体积的DR- Buffer，均匀混合。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。5.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。6.将上述操作4的溶液转移至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。7.将500ul的Rinse A加入Spin Column中，12000

28、rpm离心30秒，弃滤液。8.将700ul的Rinse B加入Spin Column中，12000rpm离心30秒，弃滤液。9.重复操作步骤8.10.将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25ul的灭菌水或Elution Buffer，静置1分钟。11.12000rmp离心1分钟洗脱DNA.2.9 目的基因片段与载体连接目的基因片段8ul载体2ulT4 DNA Ligase0.2ul10×Buffer2ul加水至20ul轻轻混匀，16水浴过夜，同时设置空载体作对照。2.10 BL21感受态细胞的制备2.10.1 从LB平板上挑取

29、新活化的Top 10单菌落，接种于35mlLB液体培养基中，37下振荡培养12小时左右； 将该菌以1：201：50的比例接种于盛有5mlLB液体培养基的试管中，于37、220r/min振荡培养12小时待吸光度A600达到为0.5左右； 将培养液转入2个1.5ml的离心管中，冰上放置510分钟，然后于4下13000r/min离心30秒；弃去上清液，用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液0.5ml每管轻轻悬浮细胞，冰上放置510分钟后，4下13000r/min离心30秒； 弃去上清液，加入0.2ml每管预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置1530分钟，即成感受态细胞悬浮

30、液； 若要保存，则加入等体积的50%甘油，混匀后每管200ul分装，80保存备用。2.11 氯化钙法转化大肠杆菌2.11.1 将2.9中连接的质粒DNA溶液加5ul于上述感受态细胞悬浮液中，轻轻摇匀，冰上放置30分钟； 42水浴中热击90秒，迅速置于冰上冷却35分钟； 向离心管中加入0.8mlLB液体培养基（不含Amp），混匀后37振荡培养0.51小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp）； 将上述菌液摇匀后取50ul涂布于含Amp的2个筛选平板上，倒置培养皿，37培养1216小时。2.12 重组克隆的筛选及鉴定初步鉴定：挑取单菌落接种于AmpLB培养基中，3725

31、0r/min摇床培养4-6小时，取培养菌作模板，运用PCR技术扩增，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，同DNA Marker对照比较分子量大小，与理论分子量大小基本一致，即初步鉴定为阳性克隆株。2.12.2酶切鉴定：取上述鉴定得到的阳性重组克隆在AmpLB培养基中扩大培养，提取质粒DNA，用XhoI和XbaI双酶切鉴定重组子，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段大小。 测序鉴定：将筛选的阳性重组克隆菌体进行测序检测。2.13 重组蛋白的表达与纯化核心基因重组菌诱导：取2mlAmp-BL培养基活化核心基因重组菌，次日转接到200mlAmp-BL培养基于37220r/min继续活化，待吸光度A

32、600达到0.61.0时，加入100ulIPTG 于37160r/min诱导培养46小时，4 12000r/min离心10分钟收集菌体。超声：将菌体用缓冲液A溶解，12000r/min离心10分钟，弃上清。将沉淀用缓冲液溶解，超声破碎菌体，功率400W，超5秒，间隔5秒，总时间约30分钟，直至超声完全（菌液清亮），12000r/min、4离心15min。保留上清和沉淀，离心后将沉淀用缓冲液B溶解，用15%SDS-PAGE电泳检测。 表达蛋白的纯化：将超声破碎后的沉淀用缓冲液B溶解再经离子交换柱纯化。 实验结果1.PCR扩增目的基因的检测结果运用两条引物扩增HCV核心抗原基因片段，PCR产物经1

33、.5%的琼脂凝胶电泳显示，在220bp处有一条特异扩增条带，分子量大小与预计值一致。（图1）图1：1.5%琼脂糖凝胶电泳图M为蛋白分子量标准条带;1为HCV核心抗原基因PCR产物。2.酶切回收将载体与目的基因均用限制性内切酶双酶切回收。（图2）图2：1.5%琼脂糖凝胶电泳图Marker为PUCMix18分子量标准；3为表达载体酶切回收产物，1、2为目的基因酶切回收产物。3.重组克隆的筛选及鉴定将回收后的目的基因片段定向连接到酶切后的表达载体中，转化大肠杆菌BL21。从转化平板上挑取6个单菌落进行培养，将培养的菌体进行PCR扩增，其扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳（如图3）,发现图3中的除5号

34、菌株外，其他菌株PCR扩增产物大小与HCV核心基因(70-140)大小一致。图 3 ：Marker为PUCMix18分子量标准，16号为挑取菌株的PCR产物选用2号菌株进行基因序列测序，结果如图4所示，测到的基因序列与GenBank序列号为AY460204中的HCV70-140完全一致。图4：HCV核心基因70-140测序图谱4、重组质粒表达：上述图3中2号菌株诱导表达后，经SDS-PAGE电泳，发现诱导后带有重组质粒的工程菌表达产物中有一相对分子量大小约为25KD左右的新蛋白区带（如图5），与目的蛋白大小一致。图5：15%SDS-PAGE蛋白胶电泳图Marker为蛋白质分子量标准；1为诱导前

35、的重组工程菌菌体；2为诱导后的重组工程菌菌体，目的蛋白大小为25KD。5、表达蛋白的纯化：重组工程菌菌体经超声破碎后，发现目的蛋白大量存在于沉淀中，超声上清液中均只含有很少的量（如图6）。图6：15%SDS-PAGE蛋白胶电泳图Marker为蛋白质分子量标准；1为超声破碎后的上清；2为诱导前的重组工程菌菌体；3为超声破碎后的沉淀讨论丙型肝炎病毒(HCV )感染所致丙型肝炎是慢性肝病的主要病因之一, 主要由输血引起, 与肝细胞癌(HCC )及肝硬化关系密切, 对人类危害巨大。目前全球范围内感染HCV 的患者约有1. 7亿人, 我国约4000万左右。HCV 感染己成为严重的世界公共卫生问题之一,

36、但迄今尚无疫苗和特异有效的治疗药物。HCV 是一种单股正链RNA 病毒, 其基因组长约9. 4 kb, 其核心蛋白位于病毒多肽的氨基末端,被宿主的信号肽酶切割后产生, 由191个氨基酸残基组成16-17。此蛋白被认为是病毒的核壳蛋白, 与HCV 其它的结构与非结构蛋白相比, 其氨基酸序列高度保守。核心蛋白高度碱性, 无糖基化位点, 且具有细胞毒性18-19 , 其结构特点使其难以在真核系统中表达。为了表达HCV核心区基因片段（C70-140）, 本研究拟构建HCV 核心蛋白的原核表达载体pBVIL-70-140、并将表达蛋白进行纯化,用于丙型肝炎核心抗原(HCV-cAg)和丙型肝炎抗体(HCV

37、-Ab)联合检测。多项研究均表明HCV 核心蛋白能够导致肝细胞恶变和肿瘤的发生, 除了参与病毒核衣壳的形成,HCV 核心蛋白还能调节基因转录, 影响细胞分化,细胞信号转导途径, 抑制宿主免疫反应 20-22 等。核心蛋白氨基酸序列上有多个B、CTL 和T 细胞的抗原表位 23 , 能诱导不同病毒株的交叉免疫应答24 , 并具有调控多种细胞基因、影响细胞生长、增生及凋亡的能力, 可能是引起宿主细胞癌变的重要因素25。因此, 核心蛋白具有的多种功能促使人们从不同角度对其进行研究, 以期探讨HCV 的致病机制, 为预防和治疗HCV 感染提供新的策略。本研究旨在在大肠杆菌中原核表达HCV 核心基因片段

38、（C70-140）,通过逆转录PCR扩增HCV核心区基因片段（C70-140），将其连接到经同样酶切的pBVIL原核表达载体中, 转化大肠埃希氏菌BL21，以IPTG诱导，SDS-PATG鉴定。结果表明，将目的基因与表达载体pBVIL进行连接，得原核表达载体pBVIL-70-140，该载体转化大肠埃希氏菌BL21后可诱导表达出分子量约为25 KD的重组蛋白。以目前广泛使用的原核表达系统大肠埃希菌来构建HCV 核心基因的表达载体。同真核表达系统相比, 大肠埃希菌具有较多的优点, 其表达目的蛋白快速、高效、经济。其本身繁殖力强。但由于原核细胞缺乏真核细胞所特有的翻译后加工修饰系统, 如糖基化等,

39、使不少具有生物活性的糖蛋白不能利用原核表达系统表达; 而且蛋白的高水平表达常形成包涵体, 而包涵体的溶解纯化步骤繁琐, 也正因为如此, 以包涵体形式表达的重组蛋白的分离纯化、以及融合蛋白的复性成为了原核表达系统应用过程中遇到的主要障碍之一。本研究还可以优化地方,如：（1）工程菌在大肠杆菌中诱导时间的优化，可以选择多个时间段诱导比较蛋白表达量，从而选择一个最佳的诱导时间；（2）诱导时IPTG的浓度优化，本实验中加入50200ul的IPTG对蛋白表达量的影响不明显，还可以在这个基础上增加或减少其浓度，比较结果，从而选取一个最佳的浓度。参考文献1. Dash S, Haque S, Joshi V,

40、 Prabhu R, Hazari S, Fermin C, GarryR. HCV-hepatocellular carcinoma: new findings and hope for effective treatment. Microsc Res Tech, 2005;68:130-148.2. Lee CM, Hung CH, Lu SN, Wang JH, Tung HD, Huang WS, Chen CL, Chen WJ, Changchien CS. Viral etiology of hepatocellular carcinoma and HCV genotypes i

41、n Taiwan. Intervirology, 2006;49:76-81.3. 中华医学会肝病学分会,中华医学会传染病与寄生虫病学分会. 丙型肝炎防治指南. 中华肝脏病杂志, 2004;12(4):194-198.4. Diedrich G. How does hepatitis C virus enter cells? FEBS J,2006;273:3871-3885.5. McHutchison JG, Bacon BR. Chronic hepatitis C:an age wave of disease burden. Am J Manag Care, 2005;11:S286-

42、S295.6. Luo GX. Cellular proteins bind to the poly(U) tract of the 3' untranslated region of hepatitis C virus RNA genome. Virology, 1999;256:105-118.7. Pawlotsky JM. Virology of hepatitis B and C viruses and antiviral targets. JHepatol, 2006;44:s10-s13.8. Kuang WF, Lin YC, Jean F, Huang YW, Tai

43、 CL, Chen DS, Chen PJ, Hwanga LH. Hepatitis C virus NS3 RNA helicase activity is modulated by the two domains of NS3 and NS4A. Biochem Biophys Res Comm, 2004;317:211-217.9. Gao L, Aizaki H, He JW, Lai MM. Interactions between viral nonstructuralproteins and host protein hVAP-33 mediate the formation

44、 of hepatitis C virus RNA replication complex on lipid raft. J Virol, 2004;78(7):3480-3488.10. 陈广灿, 李威, 曾永明. HCV 的基因结构功能与肝细胞癌相关性研究进展. 中华肿瘤防治杂志, 2006;13(2):153-155.11. Lai M, Ware C. Hepatitis C virus core protein: possible roles in viral pathogenesis. Curt Top Microbiol Immunol, 2000;242:117-134.12.

45、 McLauchlan J. Properties of the hepatitis C virus core protein:a structuralprotein that modulates cellular processes. J Viral Hepat, 2000;7(1):2-14.13. Hahm B, Kim YK, Kim JH, Kim TY, Jang SK. Heterogeneous nuclearribonucleoprotein L interacts with the 3' border of the internal ribosomal entry site of hepatitis C virus. J Virol, 1998;72(11):8782-8788.14. Li D, Takyar ST, Lott WB, Gowans EJ. Amino acids 1-20 of the hepatitis Cvirus (HC