光电技术应用於净水膜生化变化研究

1、光電技術應用於淨水膜生化變化研究黃智裕永達技術學院電子系教授，亞太綜合研究院科技所 所長黃智裕 1986年，1988年分別於成功大學電機系暨成功大學電機所碩士畢業畢業，從1991 to 1993，服務於美商 Interpoint 公司，專研厚膜混成電路，1996年於中山大學電機所博士業畢主修電磁波與天線。目前是於永達技術學院電子系教授，並參與國科會光電小組推動”光電科技應用於環境檢測技術評估”之計畫。 用於淨水的逆滲透膜上，會形成生物膜，而影響淨水效果。加州橘郡供水處的微生物研究人員，結合適當的光源、顯.影像處理技術，以最低的干擾程度，迅速地觀測生物膜的形成及清除方法。他們研發出以氮氣雷射激發

2、的染料雷射做為光源，取得理想的螢光強度分布，成功獲得淨水膜生化變化的基本資訊。 對加州 Fountain Valley 橘郡供水處的研究人員而言，水的品質是他們的一項主要課題，該處在1933年設立，承擔橘郡北區的供水任務，在1989年之前，橘郡供水處並未負責就所管轄水井中的水進行取樣和分析，在1989年，它才將水質實驗室的規模及設備擴充、升級，以因應人口的成長和地下水污染的增高，現在，每天有六百萬加侖的水，流過該處的逆滲透淨水膜。 逆滲透膜之目的在於除去雜質，包括細菌，然而逆滲透膜使用一段時間後，淨水的高分子膜上，會形成生物膜，這生物膜是一種或多種自然微生物組成的複雜結構體，這些微生物之間由細

3、菌的細胞外多醣酶(extracellular bacterial polysaccharides)膠結在一起，而這些有機物會使逆滲透膜的效率降低。生物技術研究人員，運用一光電檢測系統，其中包括透射式顯微鏡、螢光顯微鏡、CCD相機、雷射光源，及微機電技術(MEMS) 於研究生物膜的生化變化。結合微機電與光電影像分析技術的生化微生化檢驗系統的研發：針對涵蓋種類繁多的水中細菌，需要運用多種影像處理方式來偵測，同時影像系統應用到實際淨水系統中進行檢驗時，會面臨許多技術上的困難，所以研究人員開發出結合微機電元件與光電影像分析技術的微生化檢驗設備及系統，以觀察生物膜中進行著的生化過程。微機電元件的流體匣玻

4、片(flow plat)的表面結構具有層流(laminar flow)狀的渠道(channel)，內面鍍有試驗中的特定水處理高分子膜，當流體進入檢驗匣內的渠道，就會附著於高分子膜的表面，檢驗匣下方，引入透射式顯微鏡所需的光源，研究人員透過顯微鏡，觀察細菌的生化變化，若配合不同檢驗匣的高分子膜類型，研究人員可以摩擬淨化膜表面生化變化的情形(參看圖一)。圖一: 利用微機電元件技術所製作的流體檢驗匣，可以搭配正立或倒立的顯微鏡使用，它使層流狀的液體流過石英蓋玻片視窗表面。生化膜光電影像微生化檢驗系統，所採用的影像處理方式的特點是。在觀察細菌於生化膜上沉積、成長或以清潔劑清除細菌時，明視場顯微術(br

5、ight-field microscopy)和相差顯微術(phase contrast microscopy)是比較不干擾原有生化膜結構及生化過程的一種方式。 由於太強的光線會妨礙細菌的生長，所以在觀察生化膜上細菌的生長時，需要用很低照度的光源，同時也要用濾波片將光源中的紅外線成分消除，使用一種增強影像感度的CCD，可以用來攝取微弱光度的影像。根據研究結果，對於研究如何以清潔劑清除已形成的生物膜而言，雷射光源是很適合的；在研究生物膜本身結構時，通常使用相差顯微術和CCD攝影系統，為了詳細觀察生物膜上特徵的結構，研究人員需要採用二維和三維的螢光顯微術，研究人員以特定的螢光染料，標定生物膜內的特定

6、細胞的位置，以及識別細胞的特性，同時測定螢光的強度及其分布，可以穫得細胞代謝的有機物分部狀況。研究人員希望使用這種技術能找出生化膜上特定細菌的基因，未來他們還想到運用這種技術來研究特定的生物膜的螢光分析技術，例如，將膜上各處的螢光比值描繪成圖像，以顯示生物膜pH值的梯度；或偏振螢光分佈，可以顯示生化膜黏滯性的差異；以及測定曝光漂白後之螢光復元時間，能夠追蹤生物膜內的流體動態。通常螢光顯微影像分析只能獲得單色影像，該實驗室研究人員組合兩種或三種影像技術，形成一RGB碼的彩色影像，並以三維影像的方式，顯示同一個位置上一種或多種生物膜的生化變化情形。該處的研究人員用逆疊積演算法(deconvolut

7、ion algorithm)，把傳統的共焦顯微影像堆疊起來，而重建三維的影像資料，這種方法，很短時間就可以獲得完整的立體影像圖片，且可減低螢光染料長時間退化所造成的影響(參看圖三)光源的選擇上述技術的每一種應用要搭配適當的光源，例如採用白熾光源、水銀燈、氙氣短電弧閃光、或是氮氣雷射激發的染料雷射，白光可加以過濾，去掉紅外線，以避免將樣品加熱，並儘量減低曝光。相反地，以全功率使用100W水銀燈時，通常會導致螢光劑的退化，稱為光漂白(photo bleaching)，漂白程度和樣品的含氧量有關，因此觀測時需要儘量降低光漂白的影響，或者使用抗氧化劑，但是，這麼做會使樣本摻入相當可觀的雜質，使我們無法

8、以接近自然的條件檢視有機物的活體樣品。另外電弧、高氣壓氙燈，提供200到900奈米波長範圍的光源，是一種螢光顯微系統中理想的光源。圖二、螢光生化膜生顯微影像系統: 使用一7x-100x光學顯微鏡系統，觀察流體檢驗匣中生化膜上的細菌或高分子聚合物分佈之間的關系，利用自動影像攝錄系統將記錄不同螢光物質之分佈，然後在重疊影像，即可得到3D的細菌及細菌或高分子聚合物分佈情形。 高速影像擷取設備：降低入射光的強度和使用影像增感 CCD設備，是減低光漂白影響的一種方法，但是更好的方法是控制取像的光照時間，使樣本只在取像時極短的時間才受到光照，例如使用斬波器(chopper)和高速電子快門，然而這

9、種系統的操作會變得較為複雜。研究人員發現，電子閃光燈是一種很有效律的影像取像利器，使用Integral Technologies Inc. 所開發的Flash Point 128影像捕捉器(frame grabber) ，它可用來操控閃光燈，以及達成適當的數位影像擷取所需之軟、硬體配合，另外Dage MTI公司的IFG300T型的影像增強型CCD，它能夠蒯快速的記錄微弱的螢光影像畫面。圖三:三維生物膜螢光影像。他們使用propidium iodide系列的碘化物將DNA染色，胞多醣則用calcofluor white系列的染料染色，生物膜的三維螢光影像是在不同的螢光劑下攝取然後重疊在一起，每次

10、攝影都配合螢光劑反應最佳的攝像條件，細胞顯示為紅色，生物高分子聚合物則以藍色顯示。本圖為橘郡供水處的Donald W. Phipps Jr. 和Grisel G. Rodriguez所拍攝。以雷射解決問題的方案最近開發的短脈衝雷射也是一種很有效的光源，使用100微秒的脈波，每個脈波有5焦耳的能量，其中大部分能量在前20微秒釋放，再配合影像增感的CCD，就可以得到沒有衰減的螢光影像。該研究群嘗試用氮氣雷射來當做光源，以減少光漂白，並發展雷射光源應用於生化膜研究的應用。氮氣雷射的脈波寬度，和螢光顯微術所使用的螢光劑的螢光期時間相當，因此可以在很短的時間內獲得明亮的螢光，這是因為雷射光短脈波所造成的

11、激發態螢光分子，大部分不會和氧起反應，這個特點有助於避免螢光劑因為長時間受到雷射強光照射而快速退化。氮氣雷射還有其他優點，因為氮氣雷射操作簡單，而且加上染料雷射之後可以在很寬的範圍內，以微調方式選擇波長（從380到700奈米以上），所以它是一種不昂貴、高亮度的單色光源。雷射短脈波取像，適合於在有振動的雜訊環境中使用，能夠快速攝取生化變化的影像資料。橘郡供水處研究人員希望進行更進一步的實驗，來探討螢光材料和短脈波雷射光之間的交互作用，幫助我們瞭解生化膜生化變化的細部過程。螢光顯微影像技術應用於現場生化膜生化過程觀察上的困難研究水質時，雖然最好是直接攝取處理水的系列過程中有機物成長的影像，但是有相

12、當多的技術問題需要克服。首先，研究人員處理的細菌很小，很多細菌大小近乎是顯微設備解析度的極限，通常只能放大60到100倍，以保持像質清析度，同時，用來檢測細菌的螢光分析技術，只能在足夠的螢光強度下纔能得到有用的螢光影像，符合這兩種需求的光學系統，其數值孔徑必須相當大，因而景深非常短，能進行觀測的範圍很窄。這些因素使檢驗匣的觀測深度受限，所以並非只要在處理水操作中的現場，開個小視窗來觀測就可以達到的，因此研究人員研開發以微機電技術作成的特別流體檢驗匣，而得以用在他們所設計的工作檯檢驗方式。另一個重要限制是，攝取細菌影像時必須使用夠薄的玻璃，該研究群所使用的流體檢驗匣底面，通常是180m(微米)厚

13、的，並且在表面塗上適當的水處理膜，因而可以產生較好的生物膜像，然而，這麼薄的玻片會產生另一個問題。實際上許多以滲透膜處理水的系統中，是要在高壓下操作，內部水壓高達200psi，而且流率也相當高，嵌入這種系統的光學視窗，必須能承受高壓而不彎翹，同時必須薄得不致使影像發生嚴重的折射扭曲，這個窗口還必須有夠寬的透光波長範圍。藍寶石單晶是一種理想的材料，研究人員最後使用2.5mm(毫米)厚的蓋玻片來解決這個問題。原來的顯微螢光影像系統，只能取得單一像平面的螢光影像，也就是三維樣品空間的二維投影，而真正有用的螢光影像是三維的，研究人員採用井深掃描方式，重建三維的立體螢光影像。刻服了所有的實際困難之後，顯

14、微螢光影像系統能夠就廣泛的微生物生長條件及膜表面流速，重現研究人員希望預期在水處理膜內發生的化現象，並實際上，他們已經在流速較低的範圍內，看到有較厚的生物膜形成情形。References:Rodriguez, G. G., D. Phipps, K. Ishiguro, and H. F. Ridgway. 1992. Use of a fluorescent redox probe for direct visualization of actively respiring bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 58: 1801-1808. Phipps, D., G. Rodriguez and H. Ri