纳米孔生物技术的新进展

1、农产品加工2014年第12期摘要:纳米孔技术通过绝缘膜上的纳米级微孔随机地高通量识别溶液中的生物大分子。纳米孔检测原理的普遍性以The Rece n t Progress of N an opore B i otech n ologyLIU Xue(School of Che mi stry an d Che mi c a l E n g in eer in g ,Q in gd a o U ni vers i ty of Sc i e n ce an d Tech n ology ,Q in gd a o ,Sh an do n g 266042,Ch ina Abstr a ct:N an

2、 opore tech n ology e m ploys a nan osc a le hole in an in sul a t in g to stoch a st i c a lly se n se w i th h i gh throughput in d i v i du a l b i o m olecules in solut i o n.The ge n er a l i ty of the nan opore detect i o n pr in c i ple an d the e a se of s in gle m olecule detect i o n sugge

3、st man y pote n t ia l a ppl i c a t i o n s of nan opores in b i otech n ology .Rece n t progress h a s bee n ma de w i th nan opore f a br i c a t i o n an d soph i st i c a t i o n,a s well a s w i th a ppl i c a t i o n s in D NA/prote in ma pp in g ,b i o m olecul a r structure ana lys i s ,pro

4、te in detect i o n an d D NA se q ue n c in g .Key words:nan opore tech n ology ;b i o m olecul a r ;D NA se q ue n c in g收稿日期:2014-08-21基金项目:国家自然科学基金(21376129。作者简介:刘雪(1989,女,在读硕士,研究方向药物合成。0引言纳米孔的基本工作原理:纳米孔位于2个电解液室的防渗膜上,当电压作用于电解液室,便形成穿过孔的稳态离子电流。孔径中离子通量的瞬息变化使得生物大分子分布于膜上,因此检测通过孔径的电流使得分子识别成为可能。电解液室内的带电

5、分子样品(如D NA 和蛋白质在孔隙进出,产生离子电流信号的一系列波动。这些信号的波动反映了样品的许多特性,包括分子大小、浓度和结构。掌握纳米孔的尺寸、其表面特性、施加的电压以及溶液条件,就可以通过调整纳米孔来检测不同类型的生物分子。由于纳米孔检测不需要生物分子修饰、标记或表面固定化技术,因此这项技术可以检测大范围的生物分子及复合物。然而这项技术的应用需要不同孔径、不同材料的纳米孔,研究者对各项技术的改进确保了纳米孔的稳定性和分辨率,新技术和新形式的纳米孔扩大了此项技术的应用。此外,纳米孔技术作为低成本、高效率的D NA 检测技术,研究已经取得了巨大进步。本文着重介绍分子生物学技术的组合,以及

6、纳米孔技术的新进展。1纳米孔技术的改进从嵌入溶血素蛋白通道对血脂的试验研究开始,研究者们在过去10年中开发和探索了多种类型的纳米孔。-溶血素是一种能天然性地连接到细胞膜中继而导致细胞溶解的蛋白质,它第一个被用来做成生物纳米孔模型。模型中,一层生物膜将溶液分为2个区域,-溶血素蛋白嵌入生物膜中形成纳米孔。当D NA 分子穿过纳米孔时阻断电流会发生变化,这时灵敏电子元件就能检测电流的变化。但是,由于4种碱基的理化性质比较接近,所以读取序列实际上比想象的困难得多。此外,有效减少电子噪声仍旧是个挑战,通过降低D NA 的位移速率可以部分减少噪声。最近出现了新形式的仿生纳米孔,其中包括丝蛋白毛孔1和仿生

7、核孔复合物2。跨孔形成的侧电极使通过纳米孔转运的生物分子的电子检测成为可纳米孔生物技术的新进展刘雪(青岛科技大学化工学院,山东青岛266042文章编号:1671-9646(201412a -0070-02第12期(总第373期农产品加工No .122014年12月F a r m Products Process in gD ec .2014年第12期能3。采用等离子体减薄4和离子束雕刻技术5得到的超薄纳米孔也被开发出来。通过耦合到纳米孔上的扫描探针显微镜6和硅纳米线晶体管7,证实了这种使用静电效应和场效应的替代检测方式的可行性。石墨烯是一种由碳原子以sp 2杂化轨道组成六角型呈蜂巢晶格的平面薄

8、膜,目前已经成为制作超薄纳米孔膜材料8的首选。石墨烯的带电特性、韧度、原子厚度以及其电子抗渗性能,使得其成为纳米孔D NA 序列测序的热点材料。石墨烯薄片膜9和自对准碳素电击10形成方面的新进展,促进了碳纳米结构与纳米孔技术的整合。对进入纳米孔分子的自动捕捉可实现分子结构和动力学的检测分析。这项技术已经应用于对孔泡附近的扩散现象研究,这也是未来生物研究的基础。对金属孔上离子转运的研究,例如金表面的纳米孔11,可以作为一种方法用于创建种选择性纳米孔系统12,这一系统也是研究者感兴趣的生物分子检测系统。2纳米孔在生物技术上的应用迄今为止,D NA 是纳米孔研究中最常见的聚合物,脂质嵌入式离子通道检

9、测D NA 是这项研究开创性的示范。最近,固态纳米孔已用于检测核小体亚结构的不同13以及RNA 聚合酶催化D NA 转录的关键部分,为了解染色体的结构和转录研究创造了新机遇。生物纳米孔在富含鸟嘌呤的G-四链体检测方面的应用,对基因组学和表观遗传学的发展起着重要的推动作用14。脱碱基位点也可以用纳米孔动态检测,通过阻断含离子载体的电解质溶液,高压辅助下的蛋白质易位以及使用配体修饰纳米孔蛋白的不同都得到了论证15。某些蛋白质在转运时发生“解压”,转运过程便可用于成为测量解压动力学。许多这种蛋白质的解压行为已经得到了研究,纳米孔可作为无需标记的高效力谱仪16动态使用。重要的神经传导物也得到了动态实时

10、区分,以期用于研究大脑对药物的化学反应17。与其检测技术相比,纳米孔更具发展前景,其高效、快速且价格低廉,准确度和检测性能良好。其他纳米孔结构为生物领域提供了多种新研究和技术。大型固态纳米孔可以用来动态地捕获释放的细菌,为动态捕获单细胞提供了更快速低廉的方法。使用脂肽包被的固态纳米孔,可以探测到D NA 与邻近孔膜的相互作用18。热反应聚合物的提出推进了智能纳米孔的发展,智能纳米孔可以作为动态响应温度的装置,电解质刷组成的生物纳米孔可控制孔附近的盐电导。D NA 测序纳米孔的研究也取得了进展,一项最新的分子动力学研究显示,运用D NA 聚合酶作为棘轮,通过控制石墨烯纳米孔上D NA 单链的转运

11、,可获得核苷酸序列的高精读数。使用溶血素中的链霉亲和素可选择性固定D NA 链,可高分辨率区分孔上不同几何位置的核酸。P-n 半导体结可放慢D NA 易位的速度,移位过程中这种半导体结可以动态控制电压。运用新型的基于CMS O 的放大器,可实现亚微秒时间内的电流检测。关于D NA 测序的理论研究,为解决上述提到的离子电流测定速度的限制问题提出了可行性的建议和方法。模拟显示,石墨烯碳纳米带上的纳米孔可以利用孔隙边缘的电流密度,从而产生较高的分辨率。垂直于纳米通道放置的石墨烯碳纳米带上的电导变化,也被建议作为D NA 碱基易位测序设备。3结语纳米孔领域持续不断地提供有趣的新孔隙类型和生物技术的新想

12、法。基于折纸技术智能孔隙材料对于可重复性的孔隙结构发展有极大地帮助,而且结合纳米孔合成新技术作为技术支持,这种混合设备将很好地应用于几乎每种生物分子的检测。纳米孔测序技术价格低廉且测序速度较快,这项技术的发展将对遗传疾病的早期筛查和治疗产生深远的影响。参考文献:Pongprayoon P ,Beckstein O ,Sansom M S P.Biomimetic design of a brush-like nanopore :simulation studies J.J Phys Chem B ,2012,116(5:462-468.Kowalczyk S W ,Kapinos L ,Blo

13、sser T R ,et al.Single-molecule transport across an individual biomimetic nuclear pore complex J.Nat Nanotechnol ,2011(6:433-438.Guo P ,Hall E W ,Schirhagl R ,et al.Microfluidic capture and release of bacteria in a conical nanopore array J.Lab Chip ,2012,12(4:558-561.Wanunu M ,Dadosh T ,Ray V ,et al

14、.Rapid electronic detection of probe-specific micro RNAs using thin nanopore sensors J.Nat Nanotechnol ,2010,5(8:807-814.Yeh L H ,Zhang M ,Qian S ,et al.Ion concentration polarization in polyelectrolyte-modified nanopores J.J Phys Chem C ,2012,116(6:8672-8677.Hyun C ,Rollings R ,Li J L.Probing acces

15、s resistance of solidstate nanopores with a scanning -probe microscope tip J.Small ,2012,8(8:385-392.Xie P ,Xiong Q H ,Fang Y ,et al.Local electrical poten -tial detection of DNA by nanowire-nanopore sensors J.Nat Nanotechnol ,2012,7(7:119-125.Garaj S ,Hubbard W ,Reina A ,et al.Graphene as a sub -na

16、nometre trans-electrode membrane J.Nature ,2010(4:190-193.Wells D B ,Belkin M ,Comer J ,et al.Assessing graphene nanopores for sequencing DNA J.Nano Lett ,123456789刘雪,等:纳米孔生物技术的新进展(下转第74页71··农产品加工2014年第12期有不同程度抗性的转基因植物,因此抗菌肽可以在农业上作为保护植物的有效产品。但由于植物抗菌肽具有稳定性差、生产成本高等技术缺陷,目前还没有实现商业化生产。未来的研究方向应该

17、是开发毒性较小、更稳定的抗菌肽化合物,并通过改进生产工艺流程、提高多肽合成效率来降低生产成本,使得植物抗菌肽能在制药和农业技术方面得到更广阔的应用。参考文献:Hegedus N ,Marx F.Antifungial proteins :more than an -timicrobials J.Fungal Biol Rev ,2013,26(4:132-145.Pelegrini P B ,Del Sarto R P ,Silva O N ,et al.Antibac -terial peptides from plants :what they are and how they proba

18、bly work J.Biochem Res Int ,2011,10(2:239-250.Pelegrini P B ,Franco O L.Plant gamma-thionins :novel insights on the mechanism of action of amulti -functional class of defense proteins J.Int J Biochem Cell Biol ,2005,37(11:2239-2253.Pokorny A ,Almeida P F.Kinetics of dye efflux and lipid flip -flop i

19、nduced by delta -lysin in phosphatidylcholine vesicles and the mechanism of graded release by amphi -pathic ,alpha-helical peptides J.Biochemistry ,2004,43(27:8846-8857.Stotz H U ,Thomson J G ,Wang Y.Plant defensins de -fense ,development and application J.Plant Signal Be -hav ,2009,4(11:1010-1012.V

20、an der Weerden N L ,Hancock R E ,Anderson M A.Permeabilization of fungal hyphae by the plant defensin NaD1occurs through a cell wall -dependent process J.Biol Chem ,2010(48:37513-37520.Yeats T H ,Rose J K C.The biochemistry and biology of extracellular plant lipid-transfer proteins J.Protein Sci ,20

21、08,17(2:191-198.Egger M ,Hauser M ,Mari A ,et al.The role of lipid trans -fer proteins in allergic diseases J.Curr Allergy Asthma Rep ,2010,10(5:326-335.Berrocal -Lobo M ,Segura A ,Moreno M ,et al.An an -timicrobial peptide from potato whose gene is locally in -duced by wounding and responds to path

22、ogen infection J.Plant Physiol ,2002,128(3:951-961.Almasia N I ,Narhir 觡ak V ,Hopp E H ,et al.Isolation and characterization of the tissue and developmental specific potato snaking -1promoter inducible by temperature and wounding J.Plant Biotech ,2010,12(5:22-25.Craik D J.Discovery and applications

23、of plant cyclotides J.Toxicon ,2010,56(7:1092-1102.Pr 覿nting M ,L 觟觟v C ,Burman R ,et al.The cyclotide cycloviolacin O 2from viola odoratahas potent bactericidal activity against Gram -negative bacteria J.Antimicrob Chemother ,2010,65(9:1964-1971.Ireland D C ,Clark R J ,Daly N L ,et al.Isolation ,se

24、quenc -ing and structure -activity relationships of cyclotides J.Nat Prod ,2010,73(9:1610-1622.Koren E ,Torchilin V P.Cell -penetrating peptides :breaking through to the other side J.Trends Mol Med ,2012,18(7:385-393.Nasrollahi S A ,Taghibiglou C ,Azizi E ,et al.Cellpene -trating peptides as a novel

25、 transdermal drug delivery sys -tem J.Chem Biol Drug Des ,2012,80(5:639-646.Cascales L ,Henriques S T ,Kerr M C ,et al.Identifica -tion and characterization of a new family of cell penetrating peptides J.Biol Chem ,2011(42:36932-36943.Milletti F.Cell -penetrating peptides :classes ,origin ,and curre

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27、re using a viterbi algorithm J.Biophys J ,2012,102(3:37-39.Lan W J ,White H S.Diffusional motion of a particle translocating through a nanopore J.ACS Nano ,2012,6(9:1757-1765.Langecker M ,Arnaut V ,Martin T G ,et al.Synthetic lipid membrane channelsformed by designed DNA nanos -tructures J.Science ,2012(5:932-936.Soni G V ,Dekker C.Detection of nucleosomal substruc -tures using solid -state nanopores J.Nano Lett ,