黄曲霉毒素检测方法研究进展_黄洁

1、化学分析计量CHEMICAL ANALYSIS AND METERAGE第22卷,第3期2013年5月V ol. 22,No. 3May 2013100黄曲霉毒素检测方法研究进展黄洁(中国人民解放军总后勤部司令部管理保障局第二门诊部,北京100071摘要对黄曲霉毒素的检测方法薄层色谱、高效液相色谱、免疫学与仪器联用、超光谱等分析方法进行了综述,评述了上述方法的优劣、适用条件和最新进展。关键词黄曲霉毒素;检测方法;超光谱法;研究进展中图分类号:O656.3 文献标识码:A 文章编号:10086145(201303010005Research Progress in Detecting Metho

2、ds of A atoxinsHuang Jie(No.2 Clinic, Management Support Bureau, General Logistics Department, Beijing 100071, ChinaAbstract Aflatoxin detecting methods were reviewed such as TCL, HPLC, immunology and instrumentation association, hyperspectral detection methods, the pros and cons of the above method

3、s, the applicable conditions and the latest progress were reviewed.Keywords a atoxins; detecting methods; hyperspectral detection methods; research progress 在当今社会,食品安全越来越受到人们的关注和重视,尤其是在发生三聚氰胺和地沟油等一系列事件之后,人们更加重视食品安全问题。黄曲霉毒素这类真菌在世界不同地区都发现大量存在于食品中,它主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物12。目前已知的黄曲霉毒素及其衍生物有20余种,即B1

4、,B2,B2a ,G1,G2,G2a ,M1,M2等,黄曲霉毒素B1是其中毒性最大的一种,实验结果显示,其毒性是人们熟知的剧毒药氰化钾的10倍,是砒霜的68倍。黄曲霉毒素B1可诱发癌症和皮下肉瘤,并且可使动物的肝、肾、大脑和神经系统等产生病变。自20世纪60年代以来,有关黄曲霉毒素的危害被大量报道,以致黄曲霉毒素已成为最受人们关注的一种真菌毒素3。因此,寻求准确、快速、简便、价廉的检测方法,对黄曲霉毒素进行高效的定性定量分析,是黄曲霉毒素研究的一个重要方面。以下对黄曲霉毒素的检测方法研究进展进行评述。1薄层色谱法1.1薄层层析(TLC 法TLC 法是测定黄曲霉毒素的经典方法,在薄层板展开后,在

5、365 nm 紫外灯下,黄曲霉毒素B1,B2,G1和G2分别显示紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光。TLC 法的特异性较差,灵敏度相对较差,且测定黄曲霉毒素专一性不够,经常引起测量误差。但由于此法设备简单,易于普及,所以国内外仍在使用。1.2高效薄层(HPTLC 法HPTLC 法45测定黄曲霉毒素采用目前国际上流行的样品处理方法固相萃取法(SPE 中针对真菌和病毒的多功能净化(MFC 柱。采用MFC 柱净化后,仅用单相展开即可达到分离测定的目的,不仅节省了工作时间,提高了工作效率,而且进一步减少了有毒有害溶剂的用量。Stroka 等6将免疫亲合柱净化应用于TLC 法测定,进行单相展开并用荧光密度计定

6、量,此方法能检测含量明显低于当前欧盟标准的黄曲霉毒素。Kamimura 等7用HPTLC 方法测定玉米、花生、荞麦等样品,并与通过公职分析化学家协会(AOAC 认证的分析花生及花生制品中黄曲霉素的官方方法CB (Contamination Branch 法和BF (Best Foods 法进行比较,4种主要黄曲霉毒素的检测限均不高于0.2 g /kg ,回收率与CB 法一样均高于BF 法。1.3高压薄层色谱(OPTLC 法高压薄层色谱于1979年由Tyihak 提出8,它结合了经典薄层色谱法、高效薄层色谱法与高效液相色谱法的优点,是一种能够提高薄层分离效率的平面液相色谱技术。随着实验技术的不断

7、成熟,OPTLC 法在饲料和食物中黄曲霉毒素的检测方面的应用越来越多。Eszter Papp 等9发展了一系列适合检测玉米和小麦中黄曲霉毒素的OPTLC 方法。2高效液相色谱(HPLC 法由于具有稳定、准确、灵敏等优点,HPLC 法已成为当前进行黄曲霉毒素定量研究的首选方法。分析黄曲霉毒素的液相色谱方法包括正相液相色谱方联系人:黄洁;E-mail: hjeileen 收稿日期:20130329101黄洁:黄曲霉毒素检测方法研究进展法(NPLC和反相液相色谱方法(RPLC。反相高效液相色谱(RP-HPLC系统易操作,流动相具有低毒性,可同时分离、分析样品中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2且不受样

8、品沸点、热稳定性、和分子量限制,所以目前使用荧光检测器的反相HPLC法已经成为检测黄曲霉毒素的主要测定方法10。Chiavaro等11根据不同环式糊精增强黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1荧光释放的不同效果,发展了将环式糊精加入到流动相中的高效液相色谱法,黄曲霉毒素B1,B2,G1, G2的检测限均在0.3 g/kg以下,M1 的检测限在0.000 5 g/kg以下,几种黄曲霉毒素都呈线性反应关系。这种方法也被用于测定自然污染及人工添加样品。3免疫学方法黄曲霉毒素的免疫学检测方法是将生物大分子的免疫学特性与化学特性结合起来的检测方法。该方法具有快速、灵敏、对样品纯度要求不高的特点,特别适合

9、于大批量样本的检测。用于检测黄曲霉毒素的免疫学方法有酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法、亲和层析法、荧光偏振免疫测定法及免疫层析法。3.1酶联免疫吸附测定(ELISA法ELISA法是在免疫学和细胞工程学基础上发展出来的一种微量检测技术,分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法,其优点是对黄曲霉毒素B1的检测定性定量准确而且检测速度快(比薄层法提高了近200倍12,特异性强,荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰,回收率高,提取方法简单,成本较低,特别适合于对黄曲霉毒素Bl污染监测控制中大量样品的筛查1314。缺点是ELISA法中酶的活性易受反应条件影响,测定结果重复性较差,测定结果易出现假阳性

10、问题;此外ELISA试剂寿命短,需要低温保存,葡萄酒类、含盐量高的酱油、含脂量高的花生油在提取时要进行调节pH值、脱盐、脱脂等特殊处理。3.2亲和层析法亲和层析法利用免疫化学反应原理,采用大剂量的单克隆抗体,选择性吸附提取液中的抗原物质黄曲霉毒素。由于抗原抗体反应具有高灵敏、高选择、高特异性等特点,从而大大提高了试样的净化效果及检测灵敏度,同时可显著减少有毒有害试剂的使用,有利于操作人员的身体健康和环境保护。3.3放射免疫(RIA法RIA法与ELISA法基本相似,不同的是它们所使用的标记物不同,ELISA法的标记物为酶,RIA法所用的标记物一般为放射性元素氚(3H。该方法是将毒素3H标记物与样

11、品加抗体进行竞争性结合,除去未结合的部分,测定其放射性,放射性强则说明样品中毒素含量低,反之毒素含量高15。实验证明ELISA比RIA灵敏度更高且更简便,并且RIA需要特殊设备,有放射性元素污染问题,人员需要安全防护,现在已经很少使用。3.4荧光偏振免疫测定法荧光偏振免疫测定法的主要原理是荧光标记的毒素在样品缓冲液中与未荧光标记的毒素对特异性抗体的竞争性结合。分子质量越大,分子旋转速度越慢,荧光偏振值越大。Nasir等16报道了用基于荧光偏振的装置检测不同谷物中的黄曲霉毒素。3.5免疫层析(IC法IC法是20世纪80年代初发展起来的一种快速免疫分析技术,其操作简单,快速,人员不用培训,且不需特

12、殊的仪器设备,非常适用于现场测试和进行大量样品的初筛17。4免疫学与仪器结合方法近年来,随着黄曲霉毒素在食品中的检出标准越来越严格,很多人采取了免疫学与仪器结合的方法来检测黄曲霉毒素,发展了黄曲霉毒素的检测方法。4.1免疫亲和柱净化荧光光度法张艺兵等18提出了一种以免疫亲和柱净化结合荧光光度法检测黄曲霉毒素的新方法,此法利用抗原抗体对应的特异吸附特性,以黄曲霉毒素单克隆抗体为填充柱,特异性、选择性地吸附黄曲霉毒素,再以甲醇为流动相将结合的黄曲霉毒素洗脱下来然后通过溴溶液衍生,所得衍生物可发射荧光,再通过荧光光度计分析即可以测定毒素含量。此方法克服了TLC法和HPLC法在操作过程中使用剧毒的真菌

13、毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒、有异味的有机溶剂对操作人员造成身体伤害和污染环境的缺点,所需仪器设备轻便易携带,自动化程度高,操作简单,灵敏度可达1 g/kg,回收率在85%以上。一个样品只需1015 min便能直接读出测试结果,比传统方法快几个小时甚至几天时间。缺点是此法只能测定黄曲霉毒素的总量且对试剂要求比较高,检测中药材黄曲霉毒素的含量时结果会出现一些假阳性。4.2免疫亲和柱高效液相色谱法免疫亲和柱(IAC是将特异性的黄曲霉毒素单克隆抗体与载体蛋白偶联并填柱而成。由于抗原抗体有一一对应的特异性吸附关系,所以IAC能特效性地、高选择性地吸附黄曲霉毒素,而让其它杂质通过柱

14、子,使样品得以纯化,吸附的黄曲霉毒素可以被极性有机溶剂洗脱,再用HPLC法进行定量检测19,其优点是具有高度特异性,可除去绝大多数干扰物质,检测限达1 ng/g,还具有快速、溶剂使用少、可以自动化和再生利用的特点。缺点是柱成本高,商品化IAC仅适合几种毒素,有时需要加预柱净化。化学分析计量 2013年,第22卷,第3期1024.3多功能净化柱高效液相色谱法Wilson和Romer20开发了独特的真菌毒素多功能净化(MFC柱,MFC柱提供一种快速的一步萃取纯化方法,工作原理和操作过程与其它净化柱相反,它含有亲脂性(非极性和电荷活性成分(极性,当样品提取液通过柱时,MFC 柱保留样品液中的干扰物质

15、如脂肪、蛋白质类化合物和碳水化合物等,而待测组分黄曲霉毒素不被吸附而直接通过,从而一步完成净化过程,除去90%的杂质,减少了传统净化方式淋洗杂质和洗脱待测样品的步骤,从而达到净化目的,这一点是IAC和普通SPE净化柱所不具备的,并且与IAC相比净化效果同样理想,回收率高,灵敏度高,检测限低。5超光谱(HS法一直以来,黄曲霉毒素的检测都用化学方法,并且有些化学方法的检测结果非常准确,但是化学方法都要耗费大量的检测时间,检测费用较高且损坏检测样品,所以研究一种快速、准确、无损样品的检测方法对粮食产业是至关重要的,超光谱法检测黄曲霉毒就是这样一种方法。它的原理是首先通过光源激发待测样品,再通过设备捕

16、捉成像,然后对成像进行特征抽取和特征排列,最后实现区别受黄曲霉毒素污染和未受黄曲霉毒素污染的样品。Haibo Yao21等利用超光谱法分析了长波紫外线激发下的玉米粒的光谱BGYF响应,首先用中心激发波长为365 nm的紫外线光照射检测样品,被检测到黄绿色荧光的玉米粒,手动挑选出来,结果显示,在500515 nm波长范围具有较强的黄绿色荧光发射光谱峰,选取500515 nm有较强黄绿色荧光的玉米粒作为阳性组,用高效液相色谱法测定,与正常组对比,呈黄绿色荧光成像的黄曲霉毒素浓度的平均水平浓度是5.114 g/g。这个实验证明了玉米只有在感染黄曲霉毒素多的时候才会发出黄绿色荧光,所以根据BGYF测量

17、黄曲霉毒素的含量是不准确的。Haibo Yao等22还发现感染黄曲霉毒素的玉米会发生峰偏移现象,受黄曲霉毒素感染高的玉米粒其光谱峰会向长波方向移动,未受感染或者感染率低的玉米粒光谱峰会向短波方向移动,并且受黄曲霉毒素感染高的玉米粒比未受感染的玉米粒光谱峰强度低。使用超光谱法和光谱角度映射分类法对样品测试,样品荧光强度不敏感但对峰的变化敏感23,对待测玉米以20,100 ng/g为临界值做检测,分类精度为86%时有15%的假阳性率,88%时有16%的假阳性率,结果表明,超光谱法和光谱角度映射分类法可以对感染与非感染玉米进行分类。Haibo Yao等24用中心波长为365 nm的紫外光激发待测玉米

18、,用最大相似率和二进制编码两种算法分别对临界值为20,100 ng/g进行实验,并与HPLC检测结果进行对比,发现二进制编码比最大相似率分类精确,20 ng/g和100 ng/g的分类精度分别为87%, 88%。Pearson等25发现在BGYF光很弱的时候利用该检测系统无法检测到BGYF。他用一个硅光电二极管光纤光谱仪通过辨别分析,利用光的反射比从含量小于10 ng/g或者没有被污染的玉米中检测出受黄曲霉毒素污染大于100 ng/g的玉米,分类精度达到96.6%。Kalkan等26在365 nm的紫外灯下分析了285个榛子样品,在440450 nm该鉴别能力最强的谱带分类精度达到90%。Mu

19、sa Ata等27用超光谱法对红辣椒进行实验,选择卤素灯和紫外光两种光源进行对比,在对成像进行特征抽取时分为单独频带能量特征和连续绝对差异光谱波段能量两种,在成像的特征排列中用了最低冗余和最大相关性(mRMR及多层感知器连接权重(MLP,并对单独频带能量特征和连续差异光谱波段能量使用了量子直方图矩阵方法,并与HPLC检测结果做了对比,最终实验结果表明光源采用卤素灯、特征排列方法采用MLP法的分类精度最高(达91%。Haibo Yao等28研究了窄频带光谱指数加速检测黄曲霉毒素的方法,原先因为受到发射响应的限制,成像的强度位准比较低,全部的检测结果持续时间很长,而窄频带光谱可以使这种情况得到改善

20、。首先用归一化差异荧光指数(NDFI、差异化指数(DFI、荧光率指数(FRI3个指数与多谱线成像系统进行比较,发现两个系统的NDFI指数有最好的相关性,然后用窄频带光谱对25 g和1 kg的样品分别做了临界值为20,100 ng/g的实验,并与HPLC进行比较。25 g样品20,100 ng/g的分类精度为83.33%,85.26%;1 kg样品20,100 ng/g的分类精度为69.23%,95.73%。6针对黄曲霉毒素B1的快速检测方法因为黄曲霉毒素B1是黄曲霉毒素中毒性最强的,所以随着对黄曲霉毒素研究的深入,产生了很多对其快速检测的方法。6.1免疫亲和微柱检测法免疫亲和微柱检测法的原理是

21、试样提取液经过滤、稀释后,通过黄曲霉毒素B1免疫亲和柱。黄曲霉毒素B1免疫亲和柱是由偶联有黄曲霉毒素B1抗体的免疫亲和微球填充而成的,而此抗体对黄曲霉毒素B1具有专一性,样液中黄曲霉毒素B1被抗体捕获,杂质随洗涤液流出微柱,再以甲醇将黄曲霉毒素B1洗脱,洗脱液采用荧光光度法根据黄曲霉毒素B1检测工作曲线测定黄曲霉毒素B1的含量。朱剑29等用免疫亲和微柱法对大米,油脂,玉米粉做了黄曲霉毒素的检测并与酶联免疫吸附法作了比较,发现两种检测方法的准确度和灵敏度都比较高,免疫亲和微柱法比ELISA的重复性好,对植物油中黄曲霉毒素B1含量检测结果准确可靠。ELISA一次可以检测多个样本,适于大批量样103

22、黄洁:黄曲霉毒素检测方法研究进展品快速筛选,免疫亲和微柱法一次只能检测一个样本,适于单一样品现场快速检测,都比较适合基层实验室推广使用。6.2一步式金标试纸法金标免疫层析(GICA是20世纪80年代初发展起来的一种快速免疫诊断技术。一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法,快速检测试纸利用纳米金作为标记物,可在510 min完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定。它不需进行结合标记物与自由标记物的分离,省去了繁琐的加样、洗涤步骤,不仅提高了检测速度,而且检测过程中无需处理试剂,真正实现了一步式检测30。Zhang等31利用一步式金标试纸法分析一个样品,用时不到10 min

23、。在金标免疫试纸法的应用过程中,孙秀兰等32研究了样品基质对试纸条信号灵敏度的影响,为消除这些影响提供了经验。邓省亮等33用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记为抗黄曲霉毒素B1。单克隆抗体并喷于玻璃纤维上,黄曲霉毒素B1偶联抗原和二抗分别结合于硝酸纤维膜上,依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维膜和吸水纸组装切割成胶体金试纸条并装入检测卡中。测试结果表明,黄曲霉毒素B1快速检测试纸条的灵敏度为5 ng/mL,检测时间为10 min,批内和批间重复性100%,假阳性率和假阴性率均为0。6.3时间分辨荧光免疫分析法(TRFIATRFIA是超微量检测中一项新兴检测技术,灵敏度较放射免疫分析(RIA高出3个

24、数量级。TRFIA原理与ELISA 一致,不同的是TRFIA采用了一种特殊的标记物,即3价稀土离子(Eu3+,Tb3+等代替酶标记物或其它荧光物,用时间分辨荧光仪测定产物中的荧光强度,从而判断反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。TRFIA利用稀土元素荧光波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响,可大幅度提高分析的灵敏度。黄飚等34采用自制黄曲霉毒素B1全抗原和多克隆抗体,构建了一套较为完整的黄曲霉毒素B1-TRFIA检测平台,具有较好的分析稳定性,灵敏度达到0.003 9 g/L,线性范围0.003 9100 g/L。灵敏度和测量范围均超越了市场上常用的进

25、口或国产酶联免疫检测试剂(分别为0.1 g/L和0.110 g/L,经过多方面考核,各项指标符合标记免疫试剂的要求,对食品、饲料等样本检测效果均佳,具有很好的应用前景。7结语综上所述,黄曲霉毒素具有高的致癌、致畸性,因而受到全世界的广泛关注。在人们对食品安全的意识不断提高的今天,加强对黄曲霉毒素的监控和检测非常必要。纵观其发展趋势,主要有两个发展方向,即对现有方法的改进和新方法的开发。常用的检测黄曲霉毒素的方法,即薄层色谱法、酶联免疫法及高效液相色谱法,因检测速度慢、精确度低、检测费用高等原因而影响了对黄曲霉毒素监控的广泛性及检测的即时性,需要加以改进。传统检测方法的不足促使黄曲霉毒素快速、准

26、确检测方法的研发,例如超光谱法,它是一种无侵入性,无损性,快速、准确检测黄曲霉毒素的新方法,已经使用它对花生,玉米,辣椒,坚果类等进行了黄曲霉毒素的检测,并且准确度较高,是以后发展的方向;还有像电子鼻法、生物传感器等方法还不完善,需要改进,未来这些方法的发展会使快速、准确、安全的检测黄曲霉毒素成为可能。参考文献1Brown R L,Bhatnagar D,Cleveland T E,et a1. Recent advancesin preharvest prevention of mycotoxin contaminationC. KK Sinha(eds.Mycotoxins in Agri

27、culture and Food Safety. New York:Marcel Dekker,1998: 351379.2Charles L,Wilson,Samir Droby. Microbial Food ContaminationM. New York: CRC Press, 2001: 208229.3Bhatnsgar D,Yu J,Ehrlich K C. Toxins of lamentous fungiC.In: M Breitenbaeh(eds Fungal Allergy and Pathogenicity. Chem Immunol. Basel,Karger,20

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31、et al. Proceeding of the SPIE, 2010: 8 3698 369.24Yao H, et al. Processing of the SPIE, 2010: 7 6767 676.25Earson T,et al. Transactions of the ASAE,2001,44(5:1 2471 254.26Kalkan H, et al. IEEE International Conference, 2008: 414419.27Musa Atas, et al. Proc SPIE, 2011: 12.28Yao H, et al. Proceeding o

32、f SPIE, 2010, 7676: 1.化学分析计量 2013年,第22卷,第3期10429朱剑,等.粮食加工,2009,34(2: 9090.30邓瑞广,等.河南农业科学,2006(4: 9799.31Zhang Xuehui,et al. J Chromatogr Sci,2005,48(1: 4751.32孙秀兰,等.西北农林科技大学学报:自然科学版,2007,35(7:188192.33邓省亮,等.食品科学,2007,28(2: 232235.34黄飚.黄曲霉毒素A和黄曲霉毒素Bl的超微量免疫分析D.江南大学博士学位论文,2006: 8990.两会建议:食品农残检测纳入国家层面建立

33、统一的食品药品监管体系,杜绝食品添加乱象;推广使用生物农药,从源头解决农残问题。前不久,在十二届全国人大一次会议分组讨论会上,全国人大代表、安徽口子酒业股份有限公司董事长徐进就食品安全问题提出了一些建议。(1建立统一的食品药品监管体系“添加剂是食品安全问题当中的一个重要方面,尽管国家对此有着严格规定,明确了食品添加剂的品种和用量,可在实际操作过程中,却出现一系列问题,如滥用添加剂就是一个较为严重的现象。”徐进在发言时透露,国家明确规定的防腐剂是33种,每种添加剂的用量都有一个上限,可一些商家为了延长产品的销售周期,尽管不超量使用某一种添加剂,却选择同时添加几种添加剂,导致食品添加剂滥用的现象发

34、生。此外,有些食品添加剂的生产只是一些厂家的副产品,达不到相关标准。徐进还认为,多头管理是导致食品药品安全问题的重要原因之一。据介绍,我国的食品标准是由卫生部制定,工商局和食品药品管理部门进行市场管理,各部门根据职能分工各管一段,在具体实施过程中,难免出现沟通不畅的情况,从而出现了监督和执法不到位等问题。对此,徐进建议,国家应尽快建立统一的国家食品药品监管体系,解决食品药品监管当中的多头管理问题,严厉打击食品药品不法行为。(2严禁剧毒农药,尝试生物农药食品安全问题应从源头抓起,如何保证农产品的食用安全,关键是追本溯源,针对农药残留问题进行监管。如何监管农残问题,徐进提出了两点建议,一是严禁生产和使用剧毒农药,推崇生物农药;二是尽快研发出农残检测仪器,对农残现象进行严管。“农残问题令人生畏,可从市场监管来看,检测体系仍不健全。”徐进说,在实际使用过程中,大家都没有注意这个问题,可是这个问题事关民生甚至安全,应上升到国家层面。“能不能将生物农药的使用和国家惠农政策结合起来,通过给予相关补助,鼓励农民使用生态农药,并严控农民使用剧毒农药。”徐进说,尽管国家明令禁止生产剧毒农药,可一些地方为了利益,还