3491马唐草新月弯孢生物学特性

1、马唐草新月弯孢生物学特性及代谢产物活性测定杨 叶收稿日期：2008-05-12基金项目：海南省自然科学基金项目(30305)，华南热带农业大学自然科学基金项目(2003)。, 胡美姣2, 王兰英1(1.海南大学环境与植物保护学院，海南儋州，571737;2. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南儋州，571737)摘要：对马唐草新月弯孢霉（Curvularia lunata (Wakker) Boedijn）菌株MT-011的生物学特性测定结果表明：该菌株致病性强；菌丝体生长最适温度30，致死温度65/10min；最适pH值7；碳源以D-果糖最佳，氮源以硝酸钠最佳。产生分生孢子最适温度

2、30；最适pH值9；碳源以蔗糖产孢量最大，氮源以赖氨酸产孢量最高。分生孢子萌发温度在2040之间没有差异，萌发率均达90%以上；最适pH值7；光暗交替为最佳光照条件，除赖氨酸外所有供试碳源和氮源的孢子萌发率都很高，处理之间没有差异。MT-011菌株产生的活性物质作用于马唐草，可使叶片黄化或枯死脱落，与用菌体接种时造成大量叶片黄化或枯萎的症状极为相似。代谢产物对指示植物柱花草、辣椒和玉米的种子发芽后的根茎生长都有明显的抑制作用，抑制率达83.27%，表现出很好除草活性。关键词：马唐草新月弯孢霉; 生物学特性; 除草活性Characteristics and Herbicidal Activity

3、 of Metabolite Produced by Curvularia lunata from Digitaria sanguinalis Yang Ye Hu Meijiao Wang Lanying (1.Environment and Plant Protection College, Hainan University, Danzhou, Hainan 5717372.Environment and Plant Protection Institute, CATAS, Danzhou, Hainan 57173, China)Abstract：The biological char

4、acteristics of Curvularia lunata (Wakker) Boedijn (MT-011) was tested. The results showed that MT-011 displayed excellent pathoginicity. The optimum temperature and pH for mycelial growth was 30 and 6, the lethal temperature was 65/10 min; mycelium grew very well in Czapek medium with D- fructos as

5、carbon source and NaNO3 as nitrogen source. The optimum temperature and pH for sporulation was 30 and 9; the sporulation was better with sucrose as carbon source and lysine as nitrogen source. The ranges of temperature for conidial germination were 2040, the percentage of germination reached above 9

6、0%; the optimum pH was 7; alternative illumination was the best; the germination was better and very similar to adding of carbon source and nitrogen source excepted lysin. The active metabolite made the leaves yellow and wilting, which was very similar to the symptom caused by the pathogen itself. T

7、he metabolite exhibited excellent herbicidal activity against the indicator plant such as stylosanthes, capsicum and corn, and the inhibition percentage was 83.27%. The biological characteristics of Curvularia lunata (Wakker) Boedijn (MT-011) was tested. The results showed that MT-011 displayed exce

8、llent pathoginicity. The optimum temperature for mycelial growth was 30 and the lethal temperature was 65/10min; the mycelium adapted to growon PDA whose pH value was 6; among carbon and nitrogen sources, the D- fructos and NaNO3 were best for mycelium growth. The optimum temperature for sporulation

9、 was 30, the optimum pH value for sporulation was 9; the sucrose and lysine were best for sporulation. The ranges of temperature for conidial germination were 2040, the percentage of germination reached above 90%; the optimum pH value for germination was 7; alternative illumination was the best for

10、germination; all carbon and nitrogen sources were better excepted lysin for germination. The active metabolite made the leaves yellow and wilting, which was very similar to the symptom caused by the pathogen itself. The metabolite exhibited excellent herbicidal activity against the indicator plant s

11、uch as stylosanthes, capsicum and corn, and the inhibition percentage was 83.27%.The strain MT-011 of Curvularia lunata (Wakker) Boedijn was tested on biological characteristics. The results showed that MT-011 had high pathoginicity. The optimum were 30and the lethal temperature was 65/10 min for my

12、celial growth, the optimum were pH 6; the fungus grew better in Czapek medium with D- fructos as carbon source and NaNO3 as nitrogen source. The optimum were 30 and pH 9 for sporulation of strain MT-011; the sporulation grew better with sucrose as carbon source and lysine as nitrogen source. The ran

13、ges of temperature was 2040 for conidial germination, the percentage of germination to reach above 90%; the optimum were pH 7; alternative illumination was the best; the percentage of germination were better and gerniination stimulated by adding of carbon source and nitrogen source excepted lysin. T

14、he active metabolite made the leaves yellow and wilting, which was very similar to the symptom caused by the pathogen itself. The metabolite had stronger biological activity for indicator plant of stylosanthes, capsicum and corn, with inhibition percentage of 83.27% , showed good herbicidal activity

15、. Abstract: Curvularia lunata (Wakker) Boedijn; biological characteristics; herbicidal activity禾本科的马唐草Digitaria sanguinalis (L.) Scop是世界性的恶性杂草。海南由于特殊的气候条件，马唐草一年四季均可生长、随处可见，给热带农业生产造成极大危害，并给人们生活带来不便。同时，海南高温潮湿的气候非常适宜于病原菌的发生，是微生物天然宝贵的资源库。而杂草病原真菌作为杂草的天敌，对于生物除草剂的开发具有重要的研究价值。直接利用活体微生物是传统生物除草剂的主要开发途径，即采用对杂草

16、有强致病力菌株的孢子为有效成分加工成制剂。在马唐生物防除研究方面，有报道利用4隔膜中间型弯孢霉(Curvularia intermedia)及马唐黑粉菌(Ustilago syntherismae)作为马唐生防菌剂1,2。但随着杂草微生物防治研究的不断深入，许多学者发现一些杂草病原菌所产生的代谢产物具有很高的除草活性。将这些代谢产物喷施到杂草上，可以表现出与病菌接种相似的症状，并导致杂草枯死，起到防除的作用。对杂草病原菌产生的代谢产物的除草活性及毒素分离纯化等方面进行研究分析，从病原真菌中寻找除草活性物质开发抗生素除草剂或以其为模板进行仿生合成，已成为除草剂研究开发研究的热点。如姜述君等（20

17、05）研究了画眉草弯孢毒素对马唐的抑制作用3，李海涛等研究发现麦瓶草寄生疫霉的无菌培养滤液具有开发为微生物除草剂的潜力4。因此，研究病原菌代谢产物的除草活性具有重大意义，以其开发的微生物源（抗生素）除草剂，还可克服病菌活体应用中的不足，具有生产流程相对简单、易操作的特点。从2003年开始，作者对海南常见杂草病原真菌资源进行调查，获得具有强致病力的菌株MT-011，鉴定为新月弯孢霉Curvularia lunata (Wakker) Boedijn，并进行生物学特性及代谢产物除草活性等研究，对其生防价值进行初步评估，为今后进一步深入研究、开发出具有实用价值的微生物源除草剂提供依据。1 材料与方法

18、1.1 马唐草叶斑病菌菌株的致病性测定将野外健康的马唐草幼苗连土挖回实验室，移栽于花盆中种植2030d后备用。1.1.1 菌丝块的致病性测定 用金刚砂将马唐草叶子轻轻磨伤，在培养7d的MT-011菌落边缘打菌块（直径为6mm）并接到磨伤处，接无菌的培养基块为对照，共接种5盆马唐草，每盆至少接种20点。采用套塑料袋的方式进行保湿。2d后开始检查发病情况。1.1.2 孢子悬浮液的致病性测定 分别将1×105/ml的孢子悬浮液喷雾接种到健康马唐草上（共接16盆）。用清水喷雾为对照。1.1.3 代谢产物的致病性测定 打菌块接种到PDA液体培养基（100ml/瓶），每瓶接10块，共接15瓶。置

19、于28恒温箱中振荡培养7d后，将菌丝体挑出滤纸过滤，过滤液再用微孔滤膜过滤，得到不含菌体的代谢产物滤液然后喷雾接种到健康马唐草（共接16盆），其它同上。1.2 环境条件及营养对MT-011菌株的影响 光照 取直径6mm的菌块，放在PDA培养基的中央，分别置于连续光照、光暗交替和完全黑暗3种光照条件下，置于28恒温培养箱中连续培养。3d后用十字交叉法测量菌落直径，培养6d后，用血球计数板法测量其产孢量。每个处理3个培养皿，试验重复3次。把熔化的1%琼脂在灭菌载玻片上涂片，凝固备用。每支菌种加入2ml 0.1%吐温溶液（无菌水配制）洗下孢子，孢子悬浮液浓度以150200个/ml为宜，将其涂在有琼脂

20、的载玻片上。分别设全光照、全黑暗和光暗交替3种处理，放入28培养箱中保湿培养4.5个小时。每个处理3个玻片，试验重复3次。每个玻片上检查孢子100个左右，检查之前先滴希尔液固定。 温度 将菌块分别置于20、25、30、35和40的恒温培养箱中培养3d后，用十字交叉法测量菌落直径。培养6d后，用血球计数板法测量产孢量。每处理3皿，试验重复3次。同方法配孢子悬浮液，涂抹于带琼脂的载玻片上，再分别放置在20、25、30、35、40恒温培养箱中保湿培养4.5h。每个处理3个玻片，试验重复3次。菌丝致死温度的测定：移取1个菌块到无菌试管中，加入2ml灭菌水，置于40、45、50、55、60、65的恒温水

21、浴锅中加热10min，取出后立即在冰水中冷却至室温。将处理后的菌块接种到PDA平板上，置于28恒温培养箱中培养3d后，用十字交叉法测量菌落直径。培养6d后，用血球计数板法测量其产孢量。每处理6个菌块，试验重复3次。 pH值 用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl，将PDA培养基的pH值分别调节为4、5、6、7、8、9、10，制成不同pH值的固体平板备用。其它同上。将0.1%吐温溶液用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH调节pH值分别为4、5、6、7、8、9、10。在每支菌种分别加2ml不同pH值的溶液，将孢子洗下配制成孢子悬浮液，充分震荡后倒入灭菌小烧杯中备用。其它同上。 碳源

22、 以Czapek培养基为基础，用含有相同质量碳元素的甘油、葡萄糖、果糖和木糖取代其中的蔗糖，做成不同碳源固体培养基，以不加碳源作为对照。其它同上。分别将蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖和甘油溶解于灭菌水，配成碳源为5%的营养液，将孢子洗下配制成孢子悬浮液，充分震荡后倒入灭菌小烧杯中备用。其它同上。 氮源 以Czapek培养基为基础，用含有相同质量氮元素的蛋白胨、甘氨酸、赖氨酸和氯化铵取代其中的硝酸钠，以不加氮源作为对照，制成不同氮源的固体培养基。其它同上。分别将硝酸钠、蛋白胨、甘氨酸、赖氨酸和氯化铵溶解于灭菌水中，配成氮源为5%的营养液13，将孢子洗下配制成孢子悬浮液，充分震荡后倒入灭菌小烧杯中备用。

23、其它同上。1.3 除草活性测定（种子萌发鉴定法）将指示植物玉米、豆角、黄瓜、辣椒、柱花草的种子用清水洗净，放入干净的瓷盘中于28的培养箱中保湿催芽。待种子萌发露白后，将露白一致的健康种子放入铺有滤纸的培养皿，每皿10粒，滴加代谢产物滤液（制备方法见1.1.3）。以未接种的液体培养基为对照，每种处理3个皿，试验重复3次。置于28培养箱中培养35d，测量胚根、芽长及称重，计算代谢产物对种子发芽后生长的抑制率。2 结果与分析2.1致病性测定MT-011菌株菌丝块接种马唐草后2d就可观察到轻微病变，在接种处变黄，随后病斑转变为黄褐色，并向四周扩散，病斑中间灰黑色。培养4d后的平均发病率达94.82%，

24、说明此菌对马唐草具有较强的致病力（图2）。孢子悬浮液接种3d后出现症状，在叶片上出现椭圆形病斑，具有明显黄色晕圈，严重时多个病斑汇合成长条状，叶片褪绿变黄，病情随着培养时间的延长而加重。图1马唐草叶斑病菌新月弯孢霉图2 MT-011菌株菌丝块致病性测定图3 MT-011菌株代谢产物致病性测定MT-011菌株代谢产物喷施马唐草后，第3d开始出现受害症状，表现为叶片褪绿、黄化，光合作用受阻,与用菌体接种时造成大量叶片黄化或枯死脱落的症状极为相似。磨伤与不磨伤处理之间的差异不大。病情随着时间延长加重，9d后马唐草逐渐枯死（见图3）。2.2环境条件及营养对MT-011菌株的影响 光照 3种光照处理对M

25、T-011菌株菌丝体生长、产孢的作用差异均不显著，但孢子萌发率以光暗交替最高，连续黑暗和光暗交替两种处理差异达极显著；且在形态观察时发现，经光暗交替处理的孢子萌发芽管最长，连续黑暗的芽管最短。表1 不同光照对MT-011菌株的影响（4h）光处理条件菌落直径（cm）平均产孢量（个/ml）孢子萌发率（%）连续黑暗连续光照光暗交替5.01 aA5.12 aA5.14 aA5.63×107 aA7.77×107 aA2.57×107 aA82.25 Bb92.43 AaBb95.37 Aa注：表中小写字母表示差异显著（P<0.05）,大写字母表示差异极显著（P<

26、;0.01）。下同。 温度 MT-011菌株在40不能生长，菌丝体生长的最适温度为30，30与其它温度处理存在极显著差异（表2）；最适产孢温度为30，与其它温度处理达极显著差异；而孢子萌发在各处理间差异不显著，但在25时孢子萌发率最高，并且孢子萌发的芽管长度在所有处理中最长，由此可见，25为MT-011菌株孢子萌发的最适温度。表2 不同温度对MT-011菌株的影响温度()菌落直径（cm）平均产孢量（个/ml）孢子萌发率(%)温度()菌落直径（cm）平均产孢量（个/ml）孢子萌发率(%)203.240.369×107 cB91.63 aA354.061.710×107 bcB

27、97.36 aA254.773.090×107 bB99.38 aA4000 cB96.64 aA305.466.670×107 aA97.76 aA菌丝体致死温度的测定：经过60水浴处理10min后，菌丝还有活力，能在PDA上形成菌落，培养3d的菌落直径3.00cm，而经65水浴处理10min后，不能在PDA上形成菌落，MT-011菌株的致死温度为65处理10min。2.2.3 pH值 MT-011菌株在pH值58之间的菌落直径差异均不显著，菌丝体生长的酸碱适宜范围是pH58，最适pH值7；pH9时产孢最多；pH68的孢子萌发率没有显著差异，但在形态观察时发现，pH7时孢

28、子萌发的芽管长度是所有处理中最长的。表3 不同pH值对MT-011菌株的影响pH值菌落直径（cm）平均产孢量（个/ml）孢子萌发率(%)pH值菌落直径（cm）平均产孢量（个/ml）孢子萌发率(%)44.83 bcABC0.693×107 bA96.77 bC85.36 abA0.789×107 bA98.70 aBA55.41 aA1.07×107 abA96.63 bC94.58 cBC2.14×107 aA97.38 bBC65.34 abAB0.511×107 bA98.98 aA104.34 cC1.26×107 abA98.

29、62 aBA75.47 aA0.910×107 bA99.40 aA 碳源 在供试的5种碳源上，MT-011菌株都可生长，其中以D-果糖的菌落直径最大，与其它处理之间差异达极显著，其中甘油对生长有抑制作用；产孢量最多的是蔗糖，与其它碳源之间达极显著差异；以葡萄糖的孢子萌发率最高，但与其它处理间没有显著差异。表4 不同碳源和氮源对MT-011菌株的影响碳源菌落直径（cm）平均产孢量（个/ml）孢子萌发率（%）氮源菌落直径（cm）平均产孢量（个/ml）孢子萌发率（%）甘油葡萄糖D-果糖D-木糖蔗糖对照1.10eD3.67bB3.96aA3.39bcB3.56bcB2.26dC0.640&

30、#215;107cCD2.24 ×107cCD7.47×107bBC11.7×107bB28.8×107aA0.16×107dC 97.07abBA99.28aA98.24aA 98.12aA98.94 aA92.04bB氯化铵蛋白胨甘氨酸赖氨酸硝酸钠对照0.96dC4.53bB4.17cB5.45aA5.71aA5.61 aA0cB5.33×107abA7.47×107abA8.53×107aA6.40×107abA1.60×107bcAB95.71aA95.08aA94.85aA70.42b

31、B94.89aA95.37aA2.2.5 氮源 供试氮源对MT-011菌株菌丝体生长影响较大，硝酸钠生长最好，但与对照无显著差异，氯化铵则有明显抑制作用；除氯化铵处理不产孢外，其它处理如蛋白胨、甘氨酸、赖氨酸、硝酸钠之间产孢量没有显著差异；除了赖氨酸的孢子萌发率极显著低于对照及其它处理，其它氮源处理对MT-011菌株的孢子萌发与对照之间没有显著差异。2.3 MT-011菌株代谢产物的除草活性测定结果 (表7)表明：含MT-011菌株代谢产物的无菌滤液对5种供试植物种子发芽后的根茎生长都有明显的抑制作用，特别是对辣椒的根茎长的抑制率超过了83%，对重量的抑制率超过了49%。表55MT-011菌株

32、代谢产物对指示植物种子芽后生长的抑制作用科名种名学名处理数根茎抑制率(%)鲜重抑制率(%)豆科豆角Vigna sinensis13118.559.89禾本科玉米Zea mays8828.6122.49葫芦科黄瓜Cucumis sativus1710.3632.00豆科柱花草Stylosanthes3072.2839.16茄科辣椒Capsicum Frutescens3083.2749.863 结论与讨论微生物代谢产物开发为除草剂的关键在于大量发酵的营养、环境条件要求能否满足。试验表明MT-011菌株的生长速度快、产孢量大、致病性强。光照处理以光暗交替最佳，菌丝体生长、孢子萌发和产孢的温度及pH值范围均较广，菌丝的致死温度是65/10min；对菌丝生长、产孢及孢子萌发综合考虑