[农学]第二章 植物组织培养的培养条件

1、第二章第二章 植物组织培养的条件植物组织培养的条件Genotype Environment Physiology Phenotype第一节第一节 植物组织培养的条件植物组织培养的条件1. 植物组织培养最基本的前提条件：用于培养的外植体细胞必须具有全能性2.离体隔离3.适宜的培养条件 环境条件：光照、温度、湿度。 营养条件：培养基。一、环境条件一、环境条件 植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物组织培养都是在23-27 之间进行，一般采用25土2。温度温度 组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照时间方面：一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光

2、照强度较弱幼苗容易徒长。一般光照强度为10005000 lx光周期，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 光质，对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。光照光照Light x hormone responses:In vitro rooting of Prunus insititaLight Colour+NAA- NAAWhite100 81Far Red 93 10Red100100Blue 36 71Darkness100 5(From Rossi et al., 1993) 湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，容器内湿度要保持在99%左右，环境的相对湿度

3、一一般要求般要求70-80的相对的相对湿度。湿度。湿度湿度其它因素其它因素渗透压渗透压 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用， 而5-6个大气压植物 生长就会完全停止， 6个大气压以上植物 细胞就不能生存。其它因素其它因素通气状况通气状况 氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。固体培养基可加进活性炭来增加通气度固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。以利于发根。液体培养时，可考虑采取振荡培养的方式，以增加通气性。液体培养时，可考虑采取振荡

4、培养的方式，以增加通气性。二、营养条件二、营养条件培养基培养基培养基：是离体培养的组织或者细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供的近似于生物体内生存的营养环境，满足其正常生长和维持其完整结构及功能。 无机盐类：大量元素：C、H、O、N、P、K、S、Ca、Mg 微量元素：Mo、Co 、Mn、Cu、Zn、Fe等 有机营养：碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖 氮源：氨基酸类、酰胺类 活性物质：维生素类、肌醇、生物素等 生长调节物质： 生长素类：IAA、NAA、IBA等 细胞分裂素类：激动素、玉米素等 其它类：赤霉素、脱落酸、乙烯 固化剂： 琼脂、明胶、卡拉胶等培养基的组成培养基的组成 元素名称元素名称

5、添加形式添加形式 N KNO3,NH4NO3大量元素大量元素 P KH2PO4 , NaH2PO4KKCl, KNO3 , Ca CaCl2 2H2O, Ca(NO3)2 4H20或100mg/l) Mg Mg2SO4 7H2O S Mg2SO4 7H2O, Na2SO4 微量元素微量元素 Fe Fe-EDTA(Na2- EDTA+FeSO4 7H2O ) B H3BO3 Mn MnSO4 7H2O() Cu CuSO4 Mo Na2MoO4 2H2O Zn ZnSO4 7H2O I KI Co CoCl3Murashige and Skoog stock solutions (MS Medi

6、um ) Macro elements Micro elements (0.5mmol/L) (0.5mmol/L) (0.5mmol/L)MgSO4.7H2O 0.37 g/L KI 0.83 mg/LNH4NO3 1.65 g/L H3BO3 6.2 mg/LKNO3 1.9 g/L MnSO4.4H2O 22.3 mg/LCaCl2 0.33 g/L ZnSO4.7H20 8.6 mg/LKH2PO4 0.17 g/L Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L CuSO4.5H2O 0.025 mg/L CoCl2.6H2O 0.025 mg/L Na2.EDTA 37.3 g/L

7、FeSO4.7H2O 27.8 mg/L一、一、母液的配制与保存母液的配制与保存培养基母液：培养基各类溶液的浓缩液。一、一、母液的配制与保存母液的配制与保存 培养基母液：配制母液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取。一般母液配成比所需浓度高。 常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类和激素类分别配制成比培养基浓度高10-100倍的母液，低温保藏。一、一、母液的配制母液的配制(以MS为例) (一一)母液配制母液配制要求：要求： 1.母液浓缩倍数：大量元素母液浓缩倍数：大量元素10 ;微量元微量元素素10、铁盐、铁盐100;有机物有机物50100 . 2.选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化

8、学选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂纯试剂 3.防止沉淀防止沉淀 4.激素母液配制激素母液配制 混配法配制母液：配制母液时为减少工作量，将几种药品配在同一母液中。 通常大量元素、微量元素、有机物均可采用混配方法配成浓缩一定倍数的母液。collecting the ingredients无机盐L培养基中用量(mg)称取量（g）定容体积KNO3190019分别溶解后混合定容至1000 ml。NH4NO3165016.5MgSO47H2O3703.70KH2PO41701.70CaCl22H2O4404.40大量元素母液（扩大10倍） 注意：为避免发生沉淀，应注意各种化合物的组合以及加入的先后

9、顺序。 母液的浓度可用a ml/L表示，其意义为：配制1升培养基吸取该母液a毫升。Murashige and Skoog (MS） MediumMgSO4.7H2O 0.37 g/L KI 0.83 mg/LNH4NO3 1.65 g/L H3BO3 6.2 mg/LKNO3 1.9 g/L MnSO4.4H2O 22.3 mg/LCaCl2 0.33 g/L ZnSO4.7H20 8.6 mg/LKH2PO4 0.17 g/L Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L CuSO4.5H2O 0.025 mg/L甘氨酸 2mg/L CoCl2.6H2O 0.025 mg/L盐酸硫胺素（VB

10、1）盐酸吡哆醇（VB6） Na2.EDTA 37.3 g/L 烟酸 0.5 mg/L FeSO4.7H2O 27.8 mg/L肌醇 100mg/L 铁盐的配法: Fe2+在培养基中不稳定，故要用螯合剂Na2EDTA来配制，配制方法如下： 在装有400 ml蒸馏水的烧杯中加入2粒苛性钠，溶解后加入3.73g Na2 EDTA, 加热使其全部溶解，然后边搅拌，边慢慢加入2.78g FeSO47H2O直至全部溶解,冷却后定容至1000 ml（浓度10 ml/L)，倒入棕色试剂瓶棕色试剂瓶中，置于冰箱中冷藏，保存备用 单配法配制母液：对于激素类等针对不同单配法配制母液：对于激素类等针对不同培养物需要调

11、节用量的物质可配成单一化培养物需要调节用量的物质可配成单一化合物的母液。合物的母液。 这种母液的浓度一般用这种母液的浓度一般用a mg/ml。 其意义为：其意义为：每毫升母液中含有每毫升母液中含有a毫克溶质。毫克溶质。 某种激素母液浓度为某种激素母液浓度为 mg/ml，如果要配制，如果要配制该激素为该激素为0.5 mg/l的的MS培养基培养基1L，则应吸，则应吸取该激素母液取该激素母液 ml。 激素母液的配制: 激素类物质一般都难溶于水,在溶解时要借助其它溶剂使其能溶于水中. 细胞分裂素类一般先用少量1N盐酸溶解后,再加入温水冷却后定容 生长素类一般先用少量1N NaOH或酒精溶解后,再加入一

12、定量的温水,冷却后定容 。 配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制1L培养时的取用量、配制日期等，置于冰箱中冷藏保存。 培养基中的其它成分如琼脂（7g/L)、蔗糖(3%)等无需配成母液，在培养基配制时直接加入。二、培养基的配制二、培养基的配制正确的培养基配制顺序（主要步骤）： 在烧杯中加入一定量一定量的水依次加入各类母液加入蔗糖并充分溶解定容调pH值（加琼脂）分装封囗灭菌 filling the vesselsautoclaving 如何配制如何配制1L的的MS + 30g/L蔗糖蔗糖 + 2mg/L 6-BA + NAA + 玉米素玉米素 + 8g/L 琼脂培养琼脂培养基基,并分装在并分装在20个个100mL三三角烧瓶中角烧瓶中?Stock solutionMS大量大量 10MS微量微量 100MS有机有机 1006-BA 1mg/mL玉米素玉米素 0.1 mg/mL请你实践：请你实践：录相:植物的组织培养及其应用pHpH值值 组织培养最适pH是多少？如果pH值过高或过低会有什么后果?如何调节？不同植物的最适p值种 类最适pH值种 类最适pH值杜 鹃4.0月 季5.8越 桔4.5胡萝卜6.0蚕 豆5.5石刁柏7.0番茄、葡萄5.7桃