实时荧光定量PCR检测HULClncRNA方法的建立及初步应用

1、实时荧光定量PCR检测HULC lncRNA方法的建立及初步应用汪先桃 郭变琴 梁勤东 涂植光作者简介：汪先桃（1977年-），男，博士研究生，主要从事肿瘤诊断的研究* 通讯作者：涂植光（1946年-），男，教授，博士生导师，主要从事肿瘤微环境的研究电话:(23)-68485759,E-mail:tuzhiguang(重庆医科大学检验医学院 临床检验诊断学教育部重点实验室 重庆 400016)摘要目的：建立实时荧光定量PCR检测长链非编码RNA HULC的方法，探讨其在作为肝癌标志的应用价值。方法：根据Genebank中的HULC lncRNA(AY914050.1)全序列, 设计HULC基因

2、的特异引物, 构建HULC基因的T克隆载体，命名为pMD18-T-HULC；以pMD18-T-HULC为实时荧光定量PCR检测HULC的标准品，建立实时荧光定量PCR检测HULC的方法并进行方法学评价。应用此方法检测8种肿瘤细胞株、肝癌组织、其它癌及癌旁组织中HULC lncRNA的表达。结果：HULC实时荧光定量PCR检测方法学的最低检测限为1.8×103拷贝/L, 线性范围为1.8×103拷贝/L4.6×109拷贝/L；该法的批内变异系数（CV）<2.0%, 批间CV<8.0%。其在肝癌组织和肝癌细胞株起始表达量为(7.6±3.1)

3、15;105拷贝/L (5.6±3.2)×106拷贝/L，明显高于其它癌和癌旁组织HULC lncRNA表达量（<1.8×103拷贝/L）。新发现膀胱癌细胞株T24中表达量高(6.7±2.4)×105拷贝/L，但在膀胱癌组织中表达低（<1.8×103拷贝/L）。结论：成功建立了实时荧光定量PCR检测HULC lncRNA的方法，HULC lncRNA可望作为肝癌的标志。关键词HULC；lncRNA；实时荧光定量PCR；肝癌中图法分类号R446.9; R34;R73-31文献标志码Establishment of the m

4、ethod of real-time fluorescence quantitative PCR detection of HULC lncRNA and its primary applicationWANG Xiantao, GUO Bianqin, LIANG Qindong, TU Zhiguang*(College of Laboratory Medicine, Key Laboratory of Laboratory Medical Diagnostics, Ministry of Education, Chongqing Medical University, Chongqing

5、 400016, China)Abstract Objective To establish a real-time fluorescent quantitative PCR for method the detection of long non coding RNA HULC (highly up-regulated in liver cancer), and to explore its application value of hepatocellular carcinoma marker. Methods Specific primers for HULC lncRNA gene w

6、ere designed according to full HULC lncRNA sequence in Genbank (AY914050.1). The T cloning vector for the quantitative standard of HULC gene detection was constructed and named pMD18-T-HULC. The real-time fluorescence quantitative PCR method of HULC was established and methodologically evaluated. Th

7、e primary application of this method to detect HULC lncRNA in 8 types of tumor cell lines, and liver cancer and other cancer tissues was investigated. Results The minimum detection limit of established HULC real-time fluorescent quantitative PCR detection method was 1.8×103 copies /L, the linea

8、r range was 1.8×103 copies /L 4.6 ×109 copies /L, the intra-run coefficient of variation (CV) was < 2.0%, and the inter-run CV was < 8.0%. The starting expression levels of HULC lncRNA in hepatocellular carcinoma and hepatocarcinoma cell lines were (7.6±3.1)×105 copies/L (5

9、.6±3.2)×106 copies/L, significantly higher than other cancer and paracancerous tissue (all <1.8 ×103 copies /L). It was first found that HULC lncRNA was high expressed in human bladder cancer cell line T24 (6.7±2.4)×105 copies/L, but was low expressed in bladder carcinoma

10、 tissues (<1.8 ×103 copies /L). Conclusion: The real-time fluorescence quantitative PCR detection of HULC lncRNA is successfully developed, and HULC lncRNA may be a specific marker of hepatocarcinoma. Key words HULC; lncRNA; real-time fluorescence quantitative PCR; liver cancerCorresponding

11、author: TU Zhi-guang, Tel:86-23-68485759, E-mail: tuzhiguang肝癌在我国属于高发病，多数在乙肝肝硬化的基础上发展而来。目前我国发病人数约占全球的半数以上，已经成为严重威胁国人健康和生命的一大杀手。长非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是指长度超过200个核苷酸、具有调控基因表达重要生物学作用的非编码RNA。近年来研究表明, 长链非编码RNA在肿瘤的发生、发展过程中发挥着促癌或抑癌作用, 它们参与了细胞凋亡调控、肿瘤浸润与转移等过程1。随着近来lncRNA研究深入，越来越多的证据显示，肝癌中多种lncRNA

12、 表达水平发生了变化，并具有重要作用。如肺腺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung denocarcinoma transcript 1，MALAT-1）lncRNA（长约7 kb，由位于染色体11q13上的MALAT-1基因转录）和H19 lncRNA（长2.3 kb，由位于染色体11p15.5 上的H19 基因转录）在正常肝细胞中含量极低，肝癌发生时表达明显上升2-5。多数原发性肝癌中，H19 lncRNA 的表达水平高于甲胎蛋白基因表达量，其与甲胎蛋白联合检测可提高早期肝癌的确诊率4。HULC(highly up-regulated in liver c

13、ancer) 是Panzitt等2007年在肝细胞癌组织中发现的高特异性lncRNA，其具有组织和癌特异性6。由于HULC不编码蛋白，目前对其研究主要基于相对定量、定性PCR的方法进行检测，这些方法不能对起始模板进行准确定量。为此，本文利用SYBR Green 技术，建立实时荧光定量PCR方法检测HULC lncRNA，测定其在肝癌和其他种类肿瘤中临床标本和细胞株中的起始表达量，以探讨其可能的临床应用。1 材料和方法1.1 主要试剂总RNA抽提试剂盒Trizol、逆转录试剂盒primescript 1st strand cDNA synthesis kit和PCR扩增试剂SYBR Green购

14、自大连TaKaRa公司；RPM1640、SOC培养基和胰酶购自北京天根生化公司；磷酸盐缓冲液（PBS）为本室自配。1.2 细胞株与质粒肝癌Hep3B、HepG2、Hep2215、卵巢癌SKOV3、乳腺癌MCF-7、膀胱癌T24和EJ为本室常规传代保存。TOP10感受态细胞和质粒pMD18-T vecter购自大连TaKaRa公司。 1.3 标本来源肝癌组织24例、胃癌12例、卵巢癌例、乳腺癌例和膀胱癌例手术切除肿瘤和邻近非肿瘤组织等均经重庆医科大学第二附属医院经病理组织学证实。1.4总RNA提取和cDNA合成 1.4.1 总RNA提取细胞株总RNA提取是取处于对数生长期的细胞用胰酶消化, 将贴

15、壁细胞洗脱至无菌离心管中, 再用PBS洗2次，用异硫氰酸胍法提取总RNA。组织总RNA提取采用液氮研磨法，用异硫氰酸胍法快速的提取组织总RNA。提取细胞株和组织总RNA后，经真空干燥, 溶解于DEPC处理水中。测定A260nm/A280nm比值及RNA浓度，-80保存。1.4.2 cDNA合成分别取10 l RNA模板样品,依次加入逆转录试剂, 总反应体积60 l，具体操作按逆转录试剂盒说明书进行。1.5 引物设计根据GenBank的HULC（AY914050.1）全长基因序列，利用Primer Premier 5.0设计HULC特异性的引物。上游引物：5'-AACCTCCAGAACT

16、GTGAT-3'；下游引物：5'-CATAATTCAGGGAGAAAG-3'；引物是上海英俊(Invitrogen)公司合成。1.6 PCR 扩增 取HepG2 cDNA模板2l、正反向引物各0.5l、SYBR Green酶12.5l、DDH2O 9.5l, 反应体系25 l;反应条件：92预变性5 min，92 20S，5230 S，72 20 S，35个循环，72延伸5 min。1.7 HULC标准曲线的构建 1.7.1 HULC cDNA的T克隆构建根据文献报道HepG2细胞株高表达HULC基因6，所以胶回收HepG2细胞株的PCR扩增产物，操作根据胶回收试剂盒说

17、明书进行；定量后进行连接反应。Solution固定不变，调整insert DNA和vector DNA的浓度和体积，使vector DNA/insert DNA 的摩尔比值=1:210，具体比例：DNA 4.5 l；pMD18-T 0.5 l；Solution I 5 l；补ddH2O至10 L，16连接过夜。-80冰箱中取出TOP10感受态细胞，立即置于冰水上，待其融化后取 100ul加入预冷的1.5ml 灭菌EP中，取10 l连接液加入感受态细胞中，用枪头轻轻搅匀（切勿吹打），立即置于冰水上静置30min，42热击90s后立即置于冰水上大约3min，加入1ml的SOC培养基，37摇菌45m

18、in。4000rpm离心5min，保留大约200l上清液再加入20 l的IPTG。在吹干的氨苄抗性培养基表面加100 l的Xgal，用灭菌的涂布棒涂匀，再将离心管中的菌液用枪吹打均匀后均匀涂开。将平板倒置于37培养箱中，培养约14-16小时，取出放入4的冰箱中放置24小时，挑取白色菌落，小量摇菌提取质粒，并进行PCR鉴定阳性质粒，阳性质粒在Beck-man CEQ 8000测序分析仪测序，将测序证实正确的质粒命名为：pMD18-T-HULC。1.7.2 标准曲线绘制将pMD18-T-HULC进行10倍倍比稀释，取上述各梯度稀释物分别做荧光定量PCR(反应参数同上)。以拷贝数的自然对数为横坐标，

19、循环阈值(ct)为纵坐标制作标准曲线。结果计算时，将调节基线至适宜处，根据标准曲线上的浓度与Ct值的对应关系，可求出各待测标本的初始浓度。根据所取细胞的质量,将细胞HULC lncRNA表达量转换成拷贝数/L表示。1.数据处理采用SPSS19.0统计软件对数据进行统计分析。考虑实验干扰等影响，以表达量>3.0×103拷贝/为阳性，对阳性标本以表示，并进行t检验分析，以P<0.05为统计学有显著差异。2 结果2.1总RNA制备 自细胞株和组织提取的总RNA在紫外分光光度仪上测定A260 nm /A280 nm值，比值在1.92.0之间，说明无蛋白质和酚的污染。2.2 pMD

20、18-T-HULC的构建以提取的质粒为模板进行PCR鉴定，产物经1.5 gL琼脂糖凝胶电泳，可见250 bp和100 bp之间出现单一条带，与目的片段216 bp大小相符(图1)。测序结果进一步证实质粒插入片段与AY914050.1序列完全相符（测序图略）。注：DL2000：DNA marker；1：阴性对照2：pMD18-T-HULC质粒PCR产物。图1pMD18-T-HULC质粒琼脂糖凝胶电泳2.3 方法学评价；2.3.1 特异性实验：熔解曲线单一无杂峰(图3)，扩增产物Tm值均一，经序列分析Blast同源比较，扩增片段与AY914050.1序列符合率为100(序列比对图略)。图3：HUL

21、C的熔解曲线2.3.2 线性范围与最低检测限：对HULC cDNA重组质粒进行10倍倍比稀释，最低检测限为1.8×103拷贝L，线性范围为1.8×103-1.8×1012拷贝L，相关系数r2=0.964。2.3.3 稳定性实验 将PCR 反应体液在无模板cDNA的PCR 反应体中系扩增40个循环时, 荧光信号未见增加。2.3.4 重复性实验：取5份高低浓度不同浓度的标本重复测定20次，测定结果经分析其批内CV值<2.0，批间CV值<8.0。提示我们建立的方法具有良好精密度和重复性。2.4 细胞株和组织标本中HULC lncRNA含量：在细胞株中，肝癌细

22、胞株含量高，与文献报道一致3,7,8。实验新发现膀胱癌细胞株T24含量也高，但仍显著低于3种肝细胞癌细胞株表达量 (p<0.05)，其它细胞株表达量均很低(表1)。癌组织和癌旁组织HULC lncRNA测定表明：肝癌组HULC lncRNA含量显著高于癌旁组，也高于其它癌组织及癌旁组织 (表2)。表1细胞株HULC lncRNA含量(拷贝/)细胞株范围HepG24.2×106±1.0×1065.6×1062.9×106Hep3B3.8×106±1.4×1061.9×1065.2×106He

23、p22155.6×106±3.2×1061.2×1076.1×106T246.7×105±2.4×1053.1×1059.1×105MCF-7<1.8×103Skov3<1.8×103EJ<1.8×103表2癌组织和癌旁组织HULC lncRNA含量(拷贝/)标本例数范围肝癌组织247.6×105±3.1×105 1.4×1068.6×105肝癌癌旁组织24<1.8×103胃癌组织1

24、2<1.8×103胃癌癌旁组织12<1.8×103卵巢癌组织9<1.8×103卵巢癌癌旁组织9<1.8×103乳腺癌组织6<1.8×103乳腺癌癌旁组织6<1.8×103膀胱癌组织8<1.8×103膀胱癌癌旁组织8<1.8×1033讨论目前肝癌中主要的长链非编码有MALAT-1，H19和HULC。MALAT-1和H19除在肝癌组织有表达，在其它组织肿瘤也有表达，组织特异性较差。研究发现，HULC只在肝癌组织和血液中有高表达，具有较好癌和组织特异性2-8。由于HULC为

25、非编码mRNA，对其检测只能测定其拷贝数。目前报告的HULC检测方法为相对定量和半定量PCR。半定量的方法只能判断表达的有无和粗略估计拷贝数；相对定量主要应用于比较组织表达的差异，也不能检测组织的起始拷贝数。实时荧光定量PCR，能较准确反映模板基因起始量，而且具有可重复性，灵敏度高、特异性强、准确性好及高通量等特点。其中SYBR Green染料法，其分辨率高、结果精确、成本比探针法低，更具有临床实用价值。为此，我们建立了SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法，以准确测定其在不同肿瘤细胞及临床肿瘤组织、癌旁组织中HULC的起始拷贝数。HULC定位于6p24.3，含有一个内含子和两个外显子

26、，其中内含子长度为1152bp，两个外显子分别为182bp和303bp。HULC基因转录产物经过剪切和加工后形成一个500bp的RNA,具有类似于mRNA的polyA尾结构，不能编码蛋白质。设计好HULC定量检测的引物非常重要，引物的设计采用Primer5软件，引物产物跨越两个外显子。并且Primer-BLAST验证，引物具有特异性。我们构建了HULC基因的T克隆载体pMD18-T-HULC；以其为实时荧光定量PCR检测HULC的标准品，这样较好保证了检测的准确性。方法学评价表明，我们建立的HULC实时荧光定量PCR方法具有良好的线性范围、灵敏度、精确度和重复性，可满足临床检测需要。我们检测到

27、3种肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Hep 2215的HULC起始表达量>5.2×106拷贝数/L，明显高于其它肿瘤细胞株，与文献报道一致2,5-8。我们还首次发现膀胱癌细胞株T24的HULC模板起始量达到6.7×105±2.4×105拷贝数，虽然显著低于肝癌细胞株的表达量 (P<0.05)，但T24细胞株的表达也较高，尚未见文献报道。Matouk等也在膀胱癌细胞株umuc3中发现HULC有高表达8。我们的研究还发现，在膀胱癌EJ细胞株中HULC表达量却很低，并且在膀胱癌临床膀胱癌组织中也低，提示HULC仅在某些膀胱癌细胞株中可能有表达。P

28、anzitt采用相对定量PCR方法检测46例肝细胞癌切除标本中HULC的表达量比癌旁组织增加了33倍(32.7±5.0, P=0.016) 6，Matouk等采用半定量PCR在8例由结肠癌转移的肝脏肿瘤中也检测到HULC的存在8。我们通过建立的方法定量检测肿瘤组织中HULC的起始表达量，发现肝癌组织表达量明显高于包括膀胱癌在内的其它肿瘤组织和癌旁组织，说明HULC是肝癌较特异性标志，具有较高的肝癌特异性。综上所述，本研究建立了可用于临床检测的实时荧光定量PCR方法，经方法学评价及初步应用，证实了其可靠性及实用性。我们进一步证实了HULC为肝癌的较特异的标志。还新发现膀胱癌细胞株T24

29、中也有HULC的高表达。当然，有关HULC在肝癌的发生、发展中的具体作用和机制，还需进一步深入研究。参考文献1宋皓军,俞秀冲,夏天等.长链非编码RNA与肿瘤的关系及其临床价值 J.中国细胞生物学学报,2012, 34(7): 704712.2 Lin R, Maeda S, Liu C, et al . A large noncoding RNA is a marker for murine hepatocellular carcinomas and a spectrum of human carcinomas J. Oncogene , 2007,26 (6): 851-858.PMID:168781483李丹,宋咏梅,詹启敏. HULC RNA在肝癌细胞中的表达及其对邻近基因SLC35 B3表达的影响 J.中华医学杂志, 2010, 90