Menke体外产气法

1、Menke体外产气法（Syringe系统）管子（一）基础知识体外产气法主要理念通过体外产气装置模拟瘤胃发酵体外产气系统组成体外产气装置：产气管（相当于独立的瘤胃）、恒温水浴摇床（模拟瘤胃温度和蠕动速度）；微生物培养液：由瘤胃液与人工唾液按1:2的体积比混合，搅拌均匀而成影响实验成败的主要因素实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键（二）试验前准备试配产气管 更换注入口处老化的塑胶管；试配外管和内塞，要求推拉自如又不过松（现已将可匹配的外管和内塞统一编号，依号装配即可）。称量样品 产气管编号；用自制的带长柄的称量纸，准确称取待测样品约200mg（DM），置

2、于体外产气管底部，注意不要让样品进入产气管注入口和沾染30ml以上管壁；样品称取完毕后，管塞上均匀涂抹凡士林，将管塞塞回对映的外管，扣好夹子。配制原液 正式实验前一天，配制好人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）和刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放，配制方法见附表1）。其它 调试恒温水浴摇床的温度至39±0.5，摇动速度5×10转/min，如果使用两个恒温水浴摇床要求两者温度和摇动速度尽量一致，另外还需要将一多联水浴锅温度调至39±0.5（以实际量取温度为准）；准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；贮备两瓶热

3、水，准备收集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。（三）正式试验配制人工唾液 将恒温水浴摇床、多联水浴锅打开后；计算人工唾液需要量：体外培养时每根产气管内微生物培养液的体积是30ml（10ml瘤胃液和20ml人工唾液），依据试验设计的产气管数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；配制还原剂（E液，见附表1）；按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。采集与处理瘤胃液 为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液为早饲前2h瘤

4、胃液。到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温度至39±0.5，用于瘤胃液保温（应经常用热水调节）；用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意盖上瓶盖，以防氧气对微生物的影响）；回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，四层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液用CO2气体饱和；用量筒量取所需量的无色人工唾液和瘤胃液混合，不间断地通入CO2气体。吸取微生物培养液 用空的产气管吸取微生物培养液30ml，通过三通管推入已经装有样品的产气管。记录初始微生物培养液量 排气过程：将注入口处夹子打开的同时，用手下拉管塞，以防样品冲入塑胶管；摇晃产气管使样品与瘤胃液混合后，旋转管塞，排

5、出管内空气；读数：将产气管竖直，注入口向下，读取刻度。排气后的产气管应随机置于恒温水浴摇床内培养（摇床在操作过程中处于摇动状态，以免温度上升）。空白对照和标准对照实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照（样多时，对照一定要多，尤其是空白对照）。空白对照不加样品直接加入30ml微生物培养液，标准干草对照以200mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入30ml微生物培养液。为了消除操作顺序和恒温水浴摇床条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于水浴摇床的不同位置。整个过程要尽量快，特别是吸培养液和排气，最好不要超过15min记录产气量 培养2、4

6、、6、9、12、24、36、48、72、96h时（试验样品为粗料，一般培养到72h或96h；精料一般培养到24h或48h即可终止培养，若要计算产气常数，一般要72h），记录产气管的刻度读数（读数时轻摇产气管，旋动管塞后读数，读数时，以管塞刻度的中部为准）。如果产气量过多，下一时间点产气量可能超出刻度范围，则需放气，其操作与排气相同。产气量计算 （管子）式中，GPt为样品在t时刻的产气量（ml）；Vt为样品发酵t小时后，产气管刻度读数（ml）；V0为样品在开始培养时产气管刻度读数（ml）；W为样品干物质重（mg）；GP空白为空白对照在t时刻的产气量，其计算方式与GPt一致。重复试验 要求体外产气

7、试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%（若标准干草产气量与实验室积累的平均值29.5相差太大，应考虑重作，检查动物状况）。(四)样品采集测定项目取样时间取样部位取样量重复数处理保存温度VFA实际需要上清液1ml-加入0.2ml 8.2%偏磷酸，20000g离心10min4NH3-N24或48h混合液5ml-20MCP24或48h混合液24ml-20附表1：人工唾液原液配制表A、微量元素溶液：CaCl2.2H2O 13.2g;MnCl2.4H2O 10.0g;CoCl2.6H2O 1.0g;FeCl3.6H2O 8.0g;加蒸馏水至100mlB、缓冲液：NH4HCO3 4.0g;

8、NaHCO3 35.0g;加蒸馏水至1000mlC、常量元素溶液：Na2HPO4.12H2O 9.45gKH2PO4 6.2gMgSO4.7H2O 0.6g加蒸馏水至1000mlD、0.1%刃天青溶液：100mg刃天青溶解于100ml蒸馏水E、还原剂溶液（现用现配）：1M NaOH 4.0ml Na2S 9.H2O 625mg 加蒸馏水95ml附表2：人工唾液配制表（1000ml）顺 序原 液体积（ml）1蒸馏水520.22微量元素溶液（A液）0.13缓冲液（B液）208.14常量元素溶液（C液）208.150.1%刃天青溶液（D液）1.06还原剂溶液（E液）62.4嘌呤法测定体外微生物蛋白产

9、量标准曲线制备样品处理5、15、25、35、45、55mg酵母90-95水浴1h加入2ml 0.6M HClO48ml发酵液4 20000g 20min沉淀2.104ml 0.6M HClO4加入冷却加入6ml 28.5mM NH4H2PO490-95水浴15min冷却4 3000g 10min上清液1.6ml加入6ml 0.2M NH4H2PO4用85%磷酸调整溶液pH为23溶液3.8ml加入0.2ml 0.4M AgNO35避光、过夜4 3000g 10min沉淀4.5ml pH = 2 的蒸馏水冲洗4 3000g 10min沉淀加入5ml 0.5M HCl90-95水浴30min4 30

10、00g 10min上清液0.5M HCl 稀释40倍0.5M HCl作参比260nm下比色（一）操作流程图（二）试剂配制及具体操作1、试验试剂A0.2M磷酸二氢铵23g磷酸二氢铵溶解于700ml蒸馏水，定容至1000mlBpH=2的蒸馏水在蒸馏水中加少许硫酸至pH=2C0.4M硝酸银准确称取1.6987g硝酸银，溶解于15ml蒸馏水中，待完全溶解后定容至25ml。溶液需用棕色瓶存放，避光保存，并外覆不透光的黑纸D0.5M盐酸用蒸馏水稀释10ml盐酸（37%）至240mlE28.5mM磷酸二氢铵用蒸馏水稀释100ml 0.2M磷酸二氢铵至700mlF85%磷酸G0.6M高氯酸用蒸馏水稀释10ml

11、高氯酸（70%，12M）至200ml2、测定步骤A酵母RNA标准曲线的制作: 分别称取5、15、25、35、45、55mg酵母RNA于10ml离心管中，并加入2ml 0.6M HClO4，于90 - 95水浴1小时，冷却； 再分别加入6ml 28.5mM NH4H2PO4，于90 - 95水浴15min，冷却后在3000g，4条件下离心10min； 取1.6ml上清液，向上清夜中加入6ml 0.2M NH4H2PO4溶液，并用85%磷酸调整溶液pH为23（一般需85%磷酸25µl）； 取调整pH值后的溶液3.8ml，并向其中加入0.2ml 0.4M AgNO3，混合，于5条件下避光、

12、过夜； 过夜后于3000g，4条件下离心10min，弃上清液；用4.5ml pH = 2 的蒸馏水冲洗沉淀；再于3000g，4条件下离心10min，弃上清液； 向沉淀中加入5ml 0.5M HCl 溶液，混匀，在90 - 95条件下水浴30min后，以3000g离心10min； 上清液用0.5M HCl稀释40倍后，以0.5M HCl 溶液作参比，在260nm 下比色，根据光密度值作出标准曲线。B培养液中微生物蛋白质的测定: 取8ml均匀发酵液于3个10ml离心管，在20000g，4条件下离心20min；弃上清液后加入2.104ml 0.6M HClO4，于90 95水浴1小时，冷却； 按照制

13、作标准曲线的步骤-操作； 以0.5M HCl 溶液作参比，在260nm 下比色，根据光密度值和标准曲线求出RNA测定值； 根据下面公式计算微生物蛋白氮产量：微生物蛋白氮（mg/ml）=RNA测定值（mg/ml）×RNA含氮量×稀释倍数细菌氮中RNA含氮量其中，RNA含氮量为17.83%，细菌氮中RNA 含氮量为10%。浙江大学奶业科学研究所比色法测定培养液氨态氮浓度标准曲线制备样品处理0.4ml标准系列溶液加入5ml发酵液3500-4000rpm 10min2ml上清液8ml 0.2M HCl加入取0.4ml混合液加入2ml E液摇匀、静置10min0号管液作参比700nm

14、下比色摇匀2ml D液保存液工作液（一）操作流程图（二）试剂配制及具体操作1 试验试剂A0.2M盐酸溶液将18ml浓盐酸用蒸馏水稀释到1000mlB14%水杨酸钠溶液称取14g水杨酸钠，用蒸馏水溶解，定容至100mlC0.3M氢氧化钠溶液1.2g氢氧化钠用蒸馏水溶解并定容至100mlDD液称取0.08g亚硝基铁氰化钠溶解于100ml 14%水杨酸钠溶液中EE液量取2ml次氯酸钠溶液（商品名安替福明，含活性氯5.2%），混于100ml 0.3M氢氧化钠溶液中摇匀2 测定步骤A、氨氮标准系列溶液制备 准确称量0.382g氯化铵，用0.2M盐酸溶解，并定容到100ml，作为保存液，在冰箱中可存放数月

15、。 取保存液10ml，用蒸馏水稀释定容至100ml，为工作液。含氮量为10mg/100ml。 取工作液0、1、2、4、6ml置于5个编号的50ml容量瓶内，接着分别加入蒸馏水10、9、8、6、/4ml，使之都成为10ml，再用0.2M盐酸定容。这就是每100ml中含氮量为0、0.2、0.4、0.8、1.2mg的标准系列溶液。B、比色与计算 准确量取标准系列溶液0.4ml分置于5个10ml试管内，各管中再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。波长700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。记录各消光值。 用消光值作自变量，溶液含氮量作从变量导出回归方程式。 样品处

16、理：取5ml瘤胃培养液在3500-4000转/分下，离心10分钟，量取2ml上清液（若含氮量较高，可取1ml上清液再加1ml蒸馏水），置于15ml试管内，再加入8ml 0.2M盐酸至10ml摇匀（稀释倍数为5或10）。比色操作同：准确量取各溶液0.4 ml 置于10ml试管内，各管内再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。波长700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。记录各消光值。把测得的消光值代入回归公式，计算的结果乘以样品稀释的倍数就是原样中氨氮的含量。浙江大学奶业科学研究所体外发酵产物中挥发性脂肪酸浓度的测定单标测定乙、丙、丁酸各自保留时间混标制备标准曲

17、线样品中乙、丙、丁酸浓度测定（一）操作流程图（二）试剂配制及具体操作1 混标制备按表1或表2中梯度，配制6个梯度的混合标样，用于制作标准曲线。表1 乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制 （umol / ml）123456乙酸10204080160320丙酸12481632丁酸12481632表2 乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制 （ul / ml）123456乙酸0.571 1.143 2.285 4.570 9.140 18.280 丙酸0.075 0.149 0.299 0.598 1.196 2.390 丁酸0.092 0.184 0.367 0.735 1.470 2.939 2 上机测定色谱

18、柱HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱，30m×0.25mm×0.25µm气化室温度200检测室温度220柱温采用程序升温，80持续1min后，以15/min升温至170后维持1.5min载气及流速载气为高纯氮，压力为100kpa，总流量63.8ml/min，柱流量1.19ml/min，分流比50，吹扫流量3ml/min，循环流量30ml/min检测室气体流速H2流量40ml/min，空气流量400ml/min进样量2µl浙江大学奶业科学研究所发酵气体中甲烷含量的测定（一）标准曲线建立用10µl的微量注射器分别抽取1.0、2.0

19、、3.0、4.0、5.0、6.0µl的甲烷标准气，上机，根据甲烷的浓度和其峰面积的关系，确定甲烷的标准曲线。由于在测定发酵气体时取样量是20µl，故设定1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0µl的甲烷标准气的浓度分别为5、10、15、20、25、30%。（二）上机条件色谱柱HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱，30m×0.25mm×0.25µm气化室温度100检测室温度120柱温80载气及流速载气为高纯氮，压力为179.5kpa，总流量46.2ml/min，柱流量2.7ml/min，分流比15，吹扫流量3ml/

20、min，循环流量30ml/min检测室气体流速H2流量40ml/min，空气流量400ml/min进样量20µl浙江大学奶业科学研究所压力读取式体外产气法（RPT系统）产气瓶（一）基础知识体外产气法主要理念通过体外产气装置模拟瘤胃发酵体外产气系统组成体外产气装置：产气瓶（相当于独立的瘤胃）、恒温培养箱（模拟瘤胃温度）；微生物培养液：1:9的瘤胃液与人工唾液；压力传感器；PC影响实验成败的主要因素实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键（二）操作流程图（三）试剂配制及具体操作微生样品39培养加入90ml人工唾液加入10ml瘤胃液2、4、6、9、1

21、2h读取瓶内气体压力微量进样器吸取20µl气体测定CH4，放气24或48h读取瓶内气体压力微量进样器吸收20µl气体测定CH4，放气1ml上清液VFA3个1ml 混合液5ml 混合液30ml 混合液加入0.2ml 8.2%偏磷酸4 20000g 10min 4保存物NH3-NMCP-80保存-20保存-20保存1、试验前准备称量样品 产气瓶编号（因为产气量的计算涉及瓶子体积，所以尽量保留原产气瓶编号，使用新瓶时要量取瓶子体积）；加入磁力棒；准确称取待测样品一般约750mg（DM，适用0.5-1.5mgDM），置于体外产气瓶底部。配制人工唾液 计算人工唾液需要量：体外培养时每

22、个产气瓶内人工唾液的量为90ml，瘤胃液10ml，依据试验设计的产气瓶数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；配制人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）、刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放）和还原剂（E液，现用现配，见附表1）。按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。分装人工唾液 不间断地将CO2通入人工唾液瓶，用100ml注射器或产气管吸取人工唾液90ml，注入称有样品的产气瓶，并用CO2饱和（可通过三通管完成两路CO2

23、的同时输入）。盖紧橡胶塞后，39±0.5恒温培养箱内过夜（对于青贮类等含酸较多的样品，一定要过夜，而且在正式培养前将里面所产气体排空，不计入产气量）。其它 准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；贮备两瓶热水，准备收集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。2、正式试验采集与处理瘤胃液 为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温度至39±0.5，用于瘤胃液保温（应时经常热水调节）；用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶，盖好盖子；回到实验室后，将收集瓶置于水浴

24、锅内，依次用二层、四层和六层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液不间断地通入CO2气体；将密封的产气瓶从恒温箱中取出，用6.5号针头将产气瓶中多余气体放尽；用20ml注射器吸取瘤胃液10ml，通过另一16号针头注入产气瓶，将两根针头取下，产气瓶置于39±0.5恒温箱中培养。空白对照和标准对照实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照。空白对照不加样品只有90ml人工唾液和10ml瘤胃液，标准对照以750mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入90ml人工唾液和10ml瘤胃液。为了消除操作顺序和恒温培养箱条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试

25、验前期、中期和后期，放置于培养箱的不同位置。记录产气量 培养2、4、6、9、12、24、36、48h时，如果条件允许可延长培养时间，培养粗料时，至少96h或更长（有人培养一周），用压力传感器读取产气瓶内压力（轻拿、轻放），并放气。要求：使用压力传感器前，熟练软件的操作（有模拟程序可供练习）产气量计算 （瓶子）式中，GPt为样品在t时间段的产气量（ml）；Pt为t时间段读取的压力（mPa）；V0为瓶子体积；101.3为标准大气压（mPa）；W为样品干物质重。产气过程的总积累产气量为各时间段产气量之和。瘤胃发酵样品制备 培养中途取样时，要求取样同时，向产气瓶内通入CO2，并于39水浴中操作; 取混

26、合液（发酵液及固体残渣）时要求在控温磁力搅拌机上操作。重复试验 要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%。附表1：人工唾液原液配制表A、微量元素溶液：CaCl2.2H2O 13.2g;MnCl2.4H2O 10.0g;CoCl2.6H2O 1.0g;FeCl3.6H2O 8.0g;加蒸馏水至100mlB、缓冲液：NH4HCO3 4.0g;NaHCO3 35.0g;加蒸馏水至1000mlC、常量元素溶液：Na2HPO4.12H2O 9.45gKH2PO4 6.2gMgSO4.7H2O 0.6g加蒸馏水至1000mlD、0.1%刃天青溶液：100mg刃天青溶解于100ml

27、蒸馏水E、还原剂溶液（现用现配）：Cysteine HCl 625mg 蒸馏水95ml 1M NaOH 4.0ml Na2S 9.H2O 625mg 附表2：人工唾液配制表（1000ml）顺 序原 液体积（ml）1蒸馏水520.22缓冲液（B液）208.13常量元素溶液（C液）208.14微量元素溶液（A液）0.150.1%刃天青溶液（D液）1.06还原剂溶液（E液）62.4瘤胃液脂肪酸测定1ml样品85水浴30min加入0.67ml 5M NaOH加入一滴饱和甲基橙指示剂充满N2冷却加入0.67ml 5.1M HCl加入1ml 2mg/ml C17：0充满2.5ml氯仿/甲醇涡旋2min20

28、00g 10min下层溶液过硫酸钠干燥柱收集下层氯仿N2吹干1.0ml正己烷悬浮2000rpm 10min-20冻存上机测定（一）操作流程图（二）试剂配制及具体操作1、样品处理. 取1ml样品于带盖的水解管，加入0.67ml 5M NaOH和一滴饱和甲基橙指示剂后，充满N2；. 85水浴30min，冷却至室温后，加入0.67ml 5.1M HCl, 使溶液pH低于2（溶液由橙色变为红色），如果不确定，可以用pH计检测；. 加入1ml 2mg/ml 的内标C17：0；. 加入2.5ml氯仿/甲醇（2: 1,v/v）后，涡旋2min；. 将样品在2000g下离心10min；. 移去上层甲醇/水层，

29、轻轻拨开中间杂质层，将下层溶液无损失转移；. 通过含硫酸钠的干燥柱将下层氯仿滤入另一玻璃容量管；. 用氮气将样品吹干；. 用1.0ml正己烷悬浮后，简单涡旋；. 2000 rpm下离心10min，样品-20冷冻保存。2、上机条件色谱柱HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱，30m×0.25mm×0.25µm气化室温度260检测室温度270柱温采用程序升温，140持续5min后，以4/min升温至240后维持20min载气及流速载气为高纯氮，压力为100kpa，总流量87.9ml/min，柱流量0.84ml/min，线速度：25.6cm/sec，分流比

30、100，吹扫流量3ml/min，循环流量30ml/min检测室气体流速H2流量40ml/min，空气流量400ml/min进样量产气管，2µl；产气瓶4µl浙江大学奶业科学研究所Real-time PCR测定瘤胃微生物数量一、样品采集In vitro实验终止时，若分析混合微生物，可取1ml混合培养液于1.5ml灭菌离心管(也可直接用灭菌过的含0.3 g 0.1mm和0.1g 0.5mm锆珠的2ml 螺口管) -80度保存待用。若要分别分析固、液相微生物时，将混合培养液过40um尼龙袋，滤液于4度500´g 离心10，上清用于液体微生物DNA提取。尼龙袋于39度灭菌

31、水中冲洗至澄清用吸水纸吸干水份，-80度保存用于固相微生物DNA的提取。In Sacco 方法与此相似。二、总DNA的提取1 试验材料：1.5 mL EP管、螺口管、锆珠、1 mL、 200uL、20ul枪头（均需灭菌）、涡旋器、高速离心机等。2 所需试剂：NaOH、Tris碱、EDTA二钠、NaCl、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、冷乙醇。3.溶液配制方法：试剂方法A10 M NaOH称取40 g NaOH，加到100 mL水中。无需除菌。B5 M NaCl称取29.22 g NaCl，加水溶解定容至100mL。C1 M，pH 8.0 Tris-HCl称取12.114 g Tris碱，加80

32、mL水，用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至100 mL。D0.5 M，pH 8.0 EDTA将18.61 g EDTA-Na.加入80 mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用10 N的NaOH调节溶液的pH值至8.0，加水定容至100 mL。ETE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）吸取1 mL 1M的Tris-HCl和0.2 mL 0.5 M的EDTA，加水定容至100 mL。FTN150(10 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl，pH 8.0)1ml 1M的Tris-HCl和3ml 5M NaCl, 加水定容至100ml。GTris 饱和酚

33、(pH8.0)购买H24：1的氯仿异戊醇240 mL氯仿+10mL异戊醇I无水乙醇-20度保存。J70%乙醇70 mL无水乙醇加30 mL水-20度保存。4 提取步骤：液相微生物：冰上解冻样品后于4度20000g离心5min，弃上清液。加入1 mL TN150悬浮沉淀，再加150 µL的Tris饱和酚，Bead-beater匀浆（4600g，2min），冰上两分钟冷却，重复三次。固相微生物：称取0.35g 固体培养物于2ml螺口管，再称0.3g 0.1mm和0.1g 0.5mm灭菌过的锆珠。加入1 mL TN150，150 µL的Tris饱和酚，Bead-beater匀浆（

34、4600g，2min），冰上冷却两分钟，重复三次。以下步骤相同(2)加入150µL氯仿异戊醇，涡旋混匀。20000g离心5 min，上清液转至已1.5 mL EP管中。(3)加入150 µL氯仿异戊醇和150 µL Tris饱和酚，涡旋混匀1 min，10000g 离心1min，上清液转至1.5 mL EP管中。(4)重复上述步骤直至水相和有机相之间的界面清晰为止(一般需3-5次)。上清液转至1.5 mL EP管中。(5) 加入300 µL氯仿异戊醇，涡旋混匀1 min。10000g 离心1min，准确量取上清液转至1.5 mL EP管中。(6) 加入2

35、倍上清体积的冷无水乙醇及1/10倍上清体积的5 M NaCl，涡旋混匀，-20 ºC沉淀DNA 2小时（或> 30min以上）。10000g 离心10 min，弃上清。(7) 加入500 µL 70冷乙醇洗涤沉淀，10000g 离心5 min，弃上清，重复三次，风干沉淀。(8) 加入50 -100 µL TE缓冲液溶解DNA。提取的DNA部分用于紫外分光光度计测OD值，其余-20 ºC保存。(9) DNA质量检测：紫外分光光度计测OD值浓度计算：DNA（ngul）OD260×50×稀释倍数纯度：OD260OD280 为1.8 -

36、2.0，若低于此值，则可能有蛋白污染。完整性：取5 µL+1uL上样缓冲液作0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测 (DNA与上样缓冲液比例为5：1) 。三、Real-time PCR操作步骤(ABI7500)：1. 稀释DNA模板至0.5或1 ng/ul。2. 按所测微生物种类及样品数量计算出所需试剂量：(由于我们现阶段用的还是相对于总菌的定量，每一样品所测菌都要求对应一个总菌，所以同一样品最好在同一块板上同时测出所有菌，一方面可以减少试剂用量，另一方面也可以减少板与板之间的差异。每一样品设三个复孔)。举例：测包括总菌在内的5种菌时，一个96孔板可以测的样品数为：3复孔*5种菌*6个样+5种

37、菌阴性对照=95孔，或3复孔*6种菌*5个样+6种菌阴性对照=96孔，最大限度地利用96孔板)。以TaKaRa (DRR041A) SYBR Premix Ex Taq试剂盒为例：试剂使用量ulN+1个反应X种菌SYBR Premix Ex Taq (2×)1010.410.4×(N+1)需X*(N+1)个混合液，除引物不同，其余都相同，冰上操作。(*ABI7500需用ROXII校正)ROX II (50×)*0.4上游引物(10 uM)0.40.4×(N+1)下游引物(10 uM)0.40.4×(N+1)水6.86.8×(N+1)=

38、18*(N+1),分装为N个孔，每孔18ul模板(0.5 或1 ng/ul)2总体积20分装完之后，小心撕开real-time PCR专用光学透明膜覆盖于96孔板上，用刮板将膜刮紧密封在96孔板上，以防液体蒸发。稍作离心。3.反应程序 按如下程序进行：四、ABI 7500型荧光定量PCR仪操作指南 1. 开机 (1). 确认电脑与主机的数据通讯线(灰色USB连线)连接正确。 (2). 确认电脑处于外接电源供电状态。 (3). 启动电脑，进入Windows操作系统。 (4). 待桌面图标出现后，打开ABI7500主机的电源。 (5). 待主机的电源指示灯点亮后，启动7500 System Sof

39、tware应用软件。 2. 实时定量的软件运行 (1). 新建文件菜单Create new Document，Assay选择Absolute Quantification (实时定量模式)，下一步(2). 选择add detector,或者添加已有的detector到右边栏，完成，打开一个空白的96孔板文件。 .选择命名孔，双击或右击鼠标，打开Well Inspector窗口。(3).首次使用软件，或者探针（Detector）没有设置好，请点击Add Detector按钮，打开Detector Manager窗口。如果Detector列表中没有合适的探针，点击按钮File New，新建探针：设

40、定探针的名称(建议使用所研究基因符号加标记荧光，如GAPDH_FAM、ACTIN_VIC等)、报告基团(FAM或者VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA；MGB探针选None)、颜色(任意指定)等。设置完成后点击OK，该探针即出现在探针列表中。重复此过程，设立其他的探针。 (4). 在Detector Manager窗口，从探针列表中点击选择所需探针，按住Ctrl键可以选择多个探针，再点击Add to Plate Document按钮。最后点击Done关闭Detector Manager窗口。此时Well Inspector窗口仍然是打开的。 (5). 填样品表在96孔表中选定有样品

41、的一个或多个孔，在Well Inspector页面的Sample Name栏中填入样品名称；在探针列表的Use项下的方框中，打钩选择要用的一个或多个探针；在Task栏中选择指定样品类领：阴性对照选NTC；未知样品选Unknown；标准品选Standard。对于Standard，还要在Quantity栏中输入DNA拷贝数。注意：只有在这里输入拷贝数后，软件才能自动生成标准曲线。建议标准品的浓度在5点以上。建议每个样品(包括标准品)都按照统计学要求作一定数量的复管。 (6). 参比荧光 (Passive Reference)选ROX；如果使用的试剂中不含有参比荧光，请选None。完成后点击右上角的

42、X按钮，关闭Well Inspector窗口。 (7). 循环参数切换到Instrument页面，设定及修改PCR热循环程序：在ABI公司默认的程序中，50°C 2 min是UNG酶起作用的步骤，UNG酶可以预防PCR产物(其中以U代替T)对定量PCR的污染；95°C 10 min的作用是激活金牌Taq酶，同时灭活UNG酶；40个循环的95°C 15 sec和60°C 1 min是定量PCR的循环步骤。7000默认在最后一步，也就是60°C 1 min复性和延伸时收集荧光信号。如果使用ABI公司的定量PCR试剂，上述参数不需要调整，直接运行PC

43、R循环就可以了。在使用其他厂家试剂的情况下，如果其中没有UNG酶，请删除50°C 2 min步骤；如果使用的不是金牌Taq酶而是其他普通的Taq酶，请删除95°C 10 min步骤。如用的是TaKaRa试剂盒，删除50°C 2 min步骤，95°C 10 min改为95°C 5秒。(8). 循环参数的修改方法删除：按住Shift键并在相应的Stage或Step中点击，使该步骤被选中变黑，再按Del键即可删除。插入：在需要插入参数的位置点击，出现粗黑竖线后，分别点击Add Hold、Add Cycle或Add Step按钮添加保温、循环或循环中的

44、一个步骤。修改温度和时间：拖动鼠标，选中需要修改的温度或时间数字，输入新的数值即可。 (9). 其他设置：反应体积：定量PCR的标准反应体积是50 µL；使用96孔板可以用20uL，依所用试剂而定。融解曲线试验：点击Add Dissociation Stage，仪器即在定量PCR循环完成后继续做融解曲线试验。如果是采用SYBR Green I染料方法进行定量研究，建议进行融解曲线试验，以判定PCR反应特异与否。单峰表示单一的PCR扩增产物，多峰表示PCR扩增有杂带。注意：只有SYBR Green I染料方法才需要进行融解曲线试验，TaqMan探针和MGB探针法都不需要。(10). S

45、ave按钮保存文件设置。确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当后，点击Start按钮，开始PCR循环。屏幕上动态显示PCR进程和剩余时间。 (11). 监控进程切换到Results页面的Amp Plot子页面，可以实时显示PCR曲线随着循环增加而逐步增长的实际情况。可在Detector中选相应的目标观察。如果选All，则同时显示所有探针的反应进程。 (12). 程序结束后，点击Analysis Settings中的Auto Ct,再点菜单上方向或的绿色箭头分析结果，保存结果(可以保存为.sds格式，也可以保存为.sdt格式，作为以后同类实验的模板，节省软件设置时间)。退出程序，关闭ABI75

46、00主机电源。 3. 实时定量的数据分析 (1). 数据分析切换到Result页面，进入扩增曲线(Amplification Plot)子页面，查看软件已经自动分析好的实验结果。注意：此时的数据是软件根据默认值（基线起点为3，终点为15）得到的初步结果，还需要根据本次实验的具体情况，精细调节Baseline（基线）的起止点后，重新分析，以得到更精确的数据。 (2). 基线的起点和终点确定原则基线(Baseline)是指PCR开始时信号很低、接近背景且比较平稳的那个阶段。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高，设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，一般在3到6个循环之间；终点要避免覆

47、盖信号已经开始有明显增长的地方，一般在本组数据中最小的CT值前再3个循环处。另外，起点与终点之间最好能间隔8个循环以上，以满足统计基线标准偏差的数学要求。调整好起止点以后，再点击Analyze按钮，软件即自动计算新的阈值和CT值，并更新实验报告。注意：此时扩增曲线页面上显示的阈值数字并不更新，但是这不影响后台数据运算的准确。 (3). 线性图谱在默认的设置中，PCR扩增曲线图谱的纵坐标代表经过ROX和空白校正后的相对荧光信号强度，横坐标代表PCR循环次数（从1到40）；纵坐标以对数表示，横坐标以线性表示。如果要看完全线性的S形图谱，请双击纵坐标轴线，打开坐标设置窗口，将纵坐标改成线性形式。 (

48、4). 原始数据切换到Component子页面，察看原始数据。正常的SYBR信号强度，中间呈S形增长；ROX信号是水平稳定的，不随PCR进程而改变，因为ROX是以固定浓度加入到PCR试剂中的，它本身并不参与PCR扩增。 (5). 原始数据切换到Spectra子页面，也可以察看原始数据。Spectra与Component这两个页面的区别是：Component显示的是信号强度随时间(即PCR循环次数)的变化，是纵向的；而Spectra显示的是每个PCR循环点上信号强度在不同波长上的分布，也就是在4个滤色片上的分布，是横向的。 (6). 标准曲线切换到Standard Curve子页面，察看标准曲线

49、。注意：只有在Set up时输入标准品的拷贝数后，软件才能自动生成标准曲线。 (7). 实验报告切换到Report子页面，察看实验报告。确认无误后，保存结果。也可以从File菜单中选择Export，再选择数据类型，输出各种类型的数据，包括CT值、相对信号强度、原始数据、融解曲线数据和实验结果等。输出的数据可以用Excel打开，并可在Excel中重新生成扩增曲线、标准曲线等图谱。(8). 结果计算：总菌的三个Ct值算平均值，再用其他菌的Ct按如下公式计算：target(% bacterial 16S rDNA)=2-(Cttarget- Cttotal bacteria)变性梯度凝胶电泳（DGG

50、E）操作规程一 样品总DNA的提取1 试验前准备材料离心管、螺口管、锆珠、各式枪头（均需灭菌）、移液枪、涡旋器、低温离心机、Bead-beater、玻璃器材、一次性塑料手套试剂Tris、EDTA、TE饱和酚、TE缓冲液、乙酸钠、氯仿、异戊醇、无水乙醇、NaCl2试剂配制A0.5 M，pH8.0 EDTA将186.1g EDTA-Na·2H2O加入800 mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10 N的NaOH调节溶液的pH值至8.0，加水定容至1 LB1 M，pH8.0 Tris-HCl称取121.1g Tris，加800 mL水，加浓盐酸42 mL调pH至8.0。待溶液冷至室温后，方

51、可最后调定pH值。加水定容至1 LC 3 M，pH5.2 NaAc称取40.827g NaAc 溶于90 mL水中，用冰乙酸调至pH 5.2后补加水至100 mLD 氯仿/异戊醇（V/V = 24/1）量取氯仿240 mL，加入异戊醇10 mL，棕色瓶保存备用ETE缓冲液吸取1 mL 1M的Tris-HCl和0.2 mL 0.5 M的EDTA，加水定容至100 mLFTN150缓冲液称取0.8766 g的NaCl，加入1 mL 1M的Tris-HCl，加水定容至100 mLG70 冰乙醇量取无水乙醇70 mL，加入30 mL水，-20保存备用3 操作步骤 取出在-20下冻存的样品，室温解冻。1

52、0000g离心5min。弃上清液。 沉淀加人1 mL TN 150缓冲液悬浮，转移至已加入锆珠（0.1mm、0.3g）的灭菌螺口管中，再加150 µL的TE饱和酚，Bead-beater匀浆（5000g，3min），冰上冷却。3 加入150µL氯仿异戊醇，涡旋混匀。10000g离心5 min，上清液转至新管中。 加入150 µL氯仿异戊醇，和150 µL TE饱和酚，涡旋混匀1 min，10000g 离心1min，上清液转至新管中。 重复上述步骤至水相和有机相之间的界面清晰为止。 加入300 µL氯仿异戊醇，涡旋混匀1 min。10000g 离

53、心1min，上清液转至新管中。 加冷无水乙醇1mL，和50 µL 3M NaAc（pH5.2），涡旋混匀，-20 ºC沉淀DNA（> 30min）10000g 离心10 min，弃上清。 加入500 µL 70冷乙醇洗涤沉淀，10000g 离心5 min，弃上清，风干沉淀。 加入50 -100 µL TE缓冲液溶解DNA，-20 ºC保存提取的DNA。4 注意事项 酚是致癌物质，实验操作应配带手套，且不要将该溶液洒在桌面上或地面上。 试验中使用了挥发性有毒物质，操作应在通风橱中进行。 试验过程中样品应放置冰面上，所有离心操作在4 

54、6;C下进行。二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA1 试验前准备材料琼脂糖凝胶电泳系统（电泳仪、电泳槽等）、微波炉、凝胶成像系统、锥形瓶、移液枪、枪头试剂Tris、EDTA、硼酸、Goldviewer染色液、DNAMarker（一般DL2000）、琼脂糖、6×上样缓冲液、双蒸水2试剂配制A5×TBE电泳缓冲液（pH8.3）Tris 54.0 g，硼酸27.5 g，0.5 M EDTA溶液（pH8.0）20 mL，加水定容至1L。使用时稀释为0.5×TBE，4保存备用3 操作步骤 1.2 琼脂糖凝胶的制备a 将制胶槽、样品梳等清洗干净、晾干，梳子插入制胶槽中。b 称取0.6

55、 g琼脂糖置于小锥形瓶中，加入50 mL 0.5×TBE电泳缓冲液。c 在微波炉中加热溶化至完全溶解成为无颗粒状的琼脂糖凝胶液。d 待冷却至60-65 ºC，加入3 µL Goldviewer染色液。e 摇匀，轻轻倒入制胶槽中，使之形成均匀的胶面，尽量避免产生气泡。f 待凝固（30 min左右）后，拔掉样品梳，将制胶槽置于电泳槽中，倒入适量0.5×TBE电泳缓冲液，以完全浸没胶面0.2 cm左右为宜。 上样 将样品DNA与6×上样缓冲液以5：1比例混匀，用移液枪上样。每个样品槽的进样量不宜过多，以免溢出后串样。并记录上样顺序和进样量。 电泳 接通电泳仪和电泳槽的电源（注意进样孔应在负极），电压100V，电泳30 min左右。 观察和拍照 电泳结束后，将凝胶在成像系统下成像，拍照，保存。三 细菌16S rDNA片段扩增1 试验前准备材料PCR管、各式枪头（均需灭菌）、移液枪、镊子、冰盒、一次性手套