酿酒酵母INO1基因地克隆

1、酿酒酵母IN01基因的克隆黄贞杰1,2,3，叶冰莹1,2,3 ，陈由强1,2,3 (1.福建师范大学生命科学学院，福建福州350108 ； 2.农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福建福州350108 ； 3.发育与神经生物学福建省高等学校重点实验室，福建福州350108)摘要利用PCR扩增技术，以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，扩增得到酿酒酵母的结构基因，大小为1537bp 的序列。利用 NCBI对此序列进行比对，发现此序列与酿酒酵母S288C的催化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇-3-磷酸的肌醇-3-磷酸合成酶的编码基因INO1的第41到1577位序列有100 %的同源性， 而INO1的完整

2、CDS是1602bp。由此可见克隆得到的结构基因是酿酒酵母S288C的肌醇-3-磷酸合成酶的编码基因INO1，但不是全长。关键词INO1 ;酿酒酵母；基因克隆Cloning of INO1 Gene from Saccharomycescerevisiae S288CAbstract The Saccharomyces cerevisiae inositol-3-phosphatesynthase encodesgene( INO1 ) is amplified from a genomic DNA of S.ce s288c by PCR. sequence amplifiedsize is

3、 1537bp.It have 100% homology withINO1 gene complete sequence from 41 to 1577had reported. but not complete cds.Keywords INO1 Saccharomyces cerevisiae ;cloning of gene0引言随着石油能源日益耗竭，国内外许多科学家开始研究利用生物质生产燃料乙醇。乙醇被公认为不仅是一种可以代替汽油的优良液体燃料，而且是很好的燃油品质改善剂。利用非粮生物质原料生产燃料乙醇对于我国现状来说将成为一项迫切、具有重要现实意义的任务。利用甘蔗生成燃料乙醇可以充

4、分弥补利用粮食作为原材料的不足，巴西利用甘蔗生产燃料酒精的成功充分说明了这一点。然而，发酵终点高浓度的乙醇对酵母细胞生长和乙醇发酵具有强 烈抑制作用，而提高酵母菌的乙醇耐受性可以保证酵母菌发酵过程中较好的细胞活性和较高 的发酵性能，因此酵母菌的乙醇耐性重新成为世界范围内的研究热点。采用分子遗传与代谢 控制育种的方法筛选高产燃料乙醇的酿酒酵母具有重要的意义。肌醇对真核生物细胞的生长是必需的。它不仅是磷脂酰肌醇（PI）合成的前体，而且对磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰胆碱（Pc）和心磷脂（CL）合成有关酶类的表达具有调控作用1。池振明等研究2发现，在培养基中添加肌醇在某种程度上可以对耐酒精酵母菌W4的蔗

5、糖酶分泌和细胞的生长起解葡萄糖阻遏的作用。在乙醇胁迫下，Ino1的表达被证明不可缺少3,低的肌醇量影响细胞内物质的泄漏，从而影响细胞内PH、H+ ATPase的活性，改变细胞质离子稳态，进而影响膜透性屏障。高的肌醇量使ATPase的活性提高，抵偿质子流入量，触发改变脂质组成，最终提高乙醇耐受性。Min-Eui Hong等通过反向代谢工程发现过表达酿酒酵母四个内源基因（IN01, DOG1, HAL1,MSN2 ）可以促进乙醇的耐性。而过表达INO1的酵母菌具有最高的乙醇耐性，在高浓度葡萄糖下发酵具有较高的效价和体积产率。综上，为了进一步提高甘蔗等生物质发酵燃料乙醇的效率，本研究试图通过构建整合

6、表 达载体过表达催化葡萄糖6-磷酸生成肌醇-3-磷酸的肌醇-3-磷酸合成酶的编码基因INO1，得到能够耐高乙醇，较强细胞活力，发酵甘蔗汁产较高乙醇量的工程菌株。本实验首先利用PCR扩增技术，以酿酒酵母 S288C的基因组DNA为模板，克隆INO1基因，为下一步在 工业酿酒酵母中过表达，构建工程菌株奠定基础。1材料和方法1.1实验材料菌株和质粒酿酒酵母S288C :大连理工大学生命科学与技术学院惠赠；大肠杆菌DH5 a由福建师范大学农业部甘蔗遗传改良重点实验室保存。pMD-19T 克隆载体购于TAKARA公司。培养基和培养条件YPD培养基（g/L ）:酵母提取物10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2

7、0 g , pH自然，1 X 510Pa灭菌20 min。培养温度为30 C 200 rpm。大肠杆菌利用 LB培养基，37 C,对于转 化的细菌培养基中加入 100/mL的氨苄青霉素。试验试剂Ex Taq酶、酵母基因组DNA提取试剂盒购于TAKARA公司，PCR所用引物由上海生工 生物工程有限公司合成。质粒小提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；SV Gel and PCRClean-Up System （Promega）;其他分子生物学试剂均购于 TAKARA公司与Sigma公司。其他生化试剂的配制参照分子克隆实验指南。1.1.4 主要仪器和设备全自动凝胶成像分析仪（上海培清科技）;2720

8、 Thermal Cycler PCR 仪（AppliedBiosystems） ; DYY26B型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）；GeneQuant pro分光光度计（Amersham Bioscie nces）;TGL-16M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）;净化工作台（苏州净化设备有限公司）。1.2实验方法酿酒酵母基因组提取原始酿酒酵母菌株 S288C活化后，使用YPD固体培养基进行平皿划线分离得到酿酒酵 母菌株s288c单菌落，牙签挑取单菌落接至50 ml YPD液体培养基进行30 C摇瓶培养24-30 h，离心去上清；按照Takara公司酿酒酵母基因组 DNA提取

9、试剂盒提取基因组 DNA。1.2.2 INO1基因序列扩增根据NCBI上已知的酿酒酵母 S288C的肌醇-3-磷酸合成酶编码基因INO1用引物设计 软件设计引物，引物序列如下：上游引物 5 ' - TAGTTACCGACAAGTGCACGTACA -3',下游弓 I物 5'-AGTTCGTTTTGAGAAGGCAATCCA -3'以酿酒酵母S288C基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应条件如下：预变性94 C 5 min，变性94 C 30s，退火54 C 30s,延伸72 C 97s , 30个循环，延长 72 C 10min 保存 4 C。反应结束后取 2

10、 uL PCR扩增产物于1 %琼脂糖凝胶电泳进行检测。采用Promega公司的胶回收试剂盒 SV Gel and PCR Clea n-Up System进行胶回收。1.2.3 INO1基因克隆1.2.3.1 PCR 回收产物的连接与转化取回收后的PCR产物与PMD-19T 载体进行连接（表1）。连接产物采用 CaCl2法转化 E. coli DH5 a感受态细胞。在含有 IPTG与X -gal的LB/Amp平板上进行蓝白斑筛选。表1 PMD-19T载体与PCR产物连接体系Table 1 The PMD-19T vector and PCR production ligation system

11、反应物体积（MSolution I (含 DNAligase)5PMD-19T 载体1PCR回收产物3.5ddH 2O加至10稍离心混匀，16 C连接过夜1.2.3.2 阳性克隆的鉴定与质粒提取挑取白色菌落摇菌，进行菌液PCR检测。表2 菌液PCR验证Table 2 The bacteria liquidPCR for verificati on反应物体积（M10 x ExTaq Buffer1dNTP (2.5 mmol-L-1)0.8上游引物(4卩mol L-1)0.8下游引物(4卩mol L-1)0.8菌液2ExTaq 酶(5 U/ L"0.2ddH 2O加至 10PCR扩增程

12、序：预变性94 C 5 min ,变性94 C 30s ,退火54 C 30s,延伸72 C 97s , 30个循环，延长72 C 10min保存4 C。反应结束后取 3 LPCR扩增产物1 %琼脂糖凝胶 电泳进行检测。鉴定的阳性克隆用购于天根生化科技有限公司的质粒小提取试剂盒进行少量 抽提质粒。1.2.3.3 阳性克隆质粒测序测序由Takara公司完成，将测得的序列在NCBI上进行BLAST。2结果和分析2.1酿酒酵母基因组提取采用Takara公司酿酒酵母基因组 DNA提取试剂盒提取基因组 DNA。酿酒酵母s288c基 因组电泳检测如图1 ;大小符合酿酒酵母基因组大小，电泳条带清晰，说明提取

13、得到了完整 的酿酒酵母基因组。图1酿酒酵母S288C基因组提取Fig.1 Geno mic DNA extract ion from Sacchromyces cerevisiae s288cLane M :入 DNA/ Hi nd 川 DNA Marker ; Lane 1、2 Genomic DNA ofSacchromyces cerevisiae s288c2.2 INO1基因PCR扩增利用设计的引物通过PCR扩增得到一个大约有1600bp的片断（结果见图2）,与预期结果一致。图2 IN01基因的扩增泳道M : DL2000 DNA Marker ;泳道1、2 : IN01基因PCR扩

14、增产物Fig.2 Amplification of IN01 geneLane M: DL2000 DNA Marker; Lane 1、2 : PCR products of Genomic DNA2.3 INO1基因克隆将纯化后的PCR产物与PMD-19T 连接，转化 E.coli DH5 a,筛选到阳性菌落，摇菌再做菌液PCR （菌液PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图3）。鉴定的阳性克隆用质粒小提取试剂盒进行少量抽提质粒。进行琼脂糖凝胶电泳验证（见图4），结果得到一个大约有4300bp的片断，表明纯化后的 PCR产物INO1基因片段与PMD-19T 载体正确连接。将 所克隆的INO1基因

15、进行测序，得到的序列大小1537bp （图5），将测得的序列在 NCBI上进行 BLAST,结果和所报道 的INO1 基因全序列（GenBank Accession No. NM_001181586）的第41到1577位有100 %的同源性，表明所获得的目的基因是正确的但 不完整。M1232000图3菌液PCR鉴定重组子Fig.3 Ide ntificati on of some recomb inants by PCRLane M : DL 2000 DNA Marker ； Lane 13 :recombinants clone PCR products图4. INO1基因的克隆Fig.4

16、 The clo ning of ino1 geneLane M： DL 5000 DNA Marker； Lane 1、2 : PMD-19T-INO1TAGTTACCGACAAGTGCACGTACAAGGACAACGAGCTGCTCACCAAGTACAGCTAC GAAAATGCTGTAGTTACGAAGACAGCTAGTGGCCGCTTCGATGTAACGCCCACTGTT CAAGACTACGTGTTCAAACTTGACTTGAAAAAGCCGGAAAAACTAGGAATTATGCT CATTGGGTTAGGTGGCAACAATGGCTCCACTTTAGTGGCCTCGGTATTGGC

17、GAATAA GCACAATGTGGAGTTTCAAACTAAGGAAGGCGTTAAGCAACCAAACTACTTCGGCT CCATGACTCAATGTTCTACCTTGAAACTGGGTATCGATGCGGAGGGGAATGACGTTT ATGCTCCTTTTAACTCTCTGTTGCCCATGGTTAGCCCAAACGACTTTGTCGTCTCTGGT TGGGACATCAATAACGCAGATCTATACGAAGCTATGCAGAGAAGTCAAGTTCTCGAA TATGATCTGCAACAACGCTTGAAGGCGAAGATGTCCTTGGTGAAGCCTCTTCCTTCC AT

18、TTACTACCCTGATTTCATTGCAGCTAATCAAGATGAGAGAGCCAATAACTGCATCA ATTTGGATGAAAAAGGCAACGTAACCACGAGGGGTAAGTGGACCCATCTGCAACGC ATCAGACGCGATATCCAGAATTTCAAAGAAGAAAACGCCCTTGATAAAGTAATCGTTCTTTGGACTGCAAATACTGAGAGGTACGTAGAAGTA TCTCCTGGTGTTAATGACACCATGGAAAACCTCTTGCAGTCTATTAAGAATGACCATG AAGAGATTGCTCCTTCCACGATCTTTGCAGCAG

19、CATCTATCTTGGAAGGTGTCCCCTA TATTAATGGTTCACCGCAGAATACTTTTGTTCCCGGCTTGGTTCAGCTGGCTGAGCAT GAGGGTACATTCATTGCGGGAGACGATCTCAAGTCGGGACAAACCAAGTTGAAGTC TGTTCTGGCCCAGTTCTTAGTGGATGCAGGTATTAAACCGGTCTCCATTGCATCCTATA ACCATTTAGGCAATAATGACGGTTATAACTTATCTGCTCCAAAACAATTTAGGTCTAA GGAGATTTCCAAAAGTTCTGTCATAGATGACATCATCGC

20、GTCTAATGATATCTTGTACAATGATAAACTGGGTAAAAAAGTTGACCACTGCATTGTCATCAAATATATGAAGCCCGTCGGGGACTCAAAAGTGGCAATGGACGAGTATTACAG TGAGTTGATGTTAGGTGGCCATAACCGGATTTCCATTCACAATGTTTGCGAAGATTCT TTACTGGCTACGCCCTTGATCATCGATCTTTTAGTCATGACTGAGTTTTGTACAAGAG TGTCCTATAAGAAGGTGGACCCAGTTAAAGAAGATGCTGGCAAATTCGAGAACTTTT ATCCAGTTT

21、TAACCTTCTTGAGTTACTGGTTAAAAGCTCCATTAACAAGACCAGGAT TTCACCCGGTGAATGGCTTAAACAAGCAAAGAACCGCCTTAGAAAATTTTTTAAGAT TGTTGATTGGATTGCCTTCTCAAAACGAACT图5 克隆的IN01基因的核酸序列Fig.5: nucleotide sequenee ofinol gene by clone3讨论肌醇对细胞生长和对蔗糖酶分泌都具有调控作用5,在某种程度上可以起解葡萄糖阻遏的作用。因此在培养基里添加肌醇或使菌体自身大量分泌肌醇可利于酿酒酵母利用甘蔗汁发 酵产燃料乙醇。磷脂肌醇含量与酿酒

22、酵母在乙醇毒性影响下的存活有关，能够组成型产生肌醇的突变体比野生型细胞在乙醇胁迫下存活率高。因此在乙醇胁迫下，Ino1的表达是不可缺少的3。但在酿酒酵母中，肌醇合成关键酶基因INOl的表达受到产物肌醇的严密调控，这种调控作用是由于IN01基因的启动子中存在肌醇的应答序列。本实验通过 PCR法克隆得到了 IN01基因主序列，为在工业酿酒酵母中过表达，构建 工程菌株奠定基础。 可通过构建多拷贝整合表达载体在酿酒酵母内过表达IN01基因，期望得到能够耐高乙醇，较强细胞活力，发酵甘蔗汁产较高乙醇量的工程菌株。参考文献：1 Gree nberg ML,Lopes JM. Gen etic regulati on of phospholipid bios yn thesis inSaccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews.1996, 60 1):1.2 Chi Liu 乙 Ino sitol-mediated in vertase secreti on in Saccharomyces sp. W4.Enzyme and m