骨髓微环境中SMAD信号传递调控CXCL12的表达

1、ABSTRACT最近我们报导了离体情况下，SMAD独立性骨形态生成蛋白 4 （ BMP4）信号通路在造血 干细胞/祖细胞（HSPCS中活化，影响了它们导向骨髓（BM）的过程。本文中，我们评估了活体中，影响BM龛是否会导致 BMP信号传递过程发生改变。我们揭示了注入BMP拮抗剂头蛋白（Noggin）来抑制SMAD依赖性BMP信号转导，显著增加了 BM血浆中CXCL12的 水平，增强了植入 HSPCS的导向与血管生成。 反过来，注入BMP7而不是BMP4,造成HSPC 导向能力下降。利用ST2细胞充当BM龛的体外模型，我们发现在中和抗 BMP4抗体，NGN, 或背成形因子 （ Dorsomorph

2、in, DM ）同时敲除掉 Smad1/5 及 BMP4 的条件下孵化， 所有这些 都增强了 CXCL12的产生。染色质免疫沉淀分析识别出了CXCL12启动子中与SMAD4结合的元件。删除这个元件后，观察到CXCL12启动子活性增加，并且 NGN或DM不再影响Cxcl12表达。有趣的是，BMP7表达只出现在成骨细胞中，不出现在其它龛成分中。因此，我们将 SMAD依赖性BMP信号转导描述为 BM龛中一种新的 CXCL12生产调控因子，影响 HSPC的 导向，移植成活以及运动。INTRODUCTION在治疗多种类型癌症，骨髓（ BM）衰竭中，遗传性代谢障碍，以及严重先天性免疫缺 陷时，常常使用造血

3、干细胞 （HSC移植（1）。在骨髓中，HSCs与其所处的微环境相互作用， 这种微环境也称为“龛”。最初提出HSCs与成骨细胞有关（2），然而后来发现许多 HSCs与 窦状小管内皮有关（3）。移植后的造血重建，需要HSCs有效地导向到BM龛中。多种从细胞分泌到BM龛中的细胞因子和生长因子调控着HSCs的维持和分化（4）。HSCs也表达一系列黏附受体，接受BM中不同类型细胞分泌的配体，使得植入的HSCs可以导向和定居（5）。黏附受体表达情况的改变，或其与龛中相应受体之间相互作用的改变，不止会引起HSC动员，也会使HSC难以维持（6）。细胞因子 CXCL12及其G蛋白耦联受体（GPCR CXCR4在

4、造血干细胞/祖细胞迁移到 BM，以及定居于龛的过程中起主要作用（711）。基于Mx-cre技术，将CXCR4从成年小鼠HSCs中条件性删除，显示出CXCR4对维持原始HSCs很重要（10）。这一相互作用对于人类及小鼠HSCs植入受辐射处理后的宿主体内后，进行导向的过程十分重要（10, 11）。由BM龛细胞产生的一种 CXCL12细胞因子浓度梯度，吸引着植入的HSCs前来，它们首先黏附于内 皮并滚动，然后通过穿内皮迁移，穿入组织（12）。根据表达 CXCL12的细胞类型，CXCL12不同地影响HSCs的维持，和谱系定型祖细胞的维持（13，14）。尽管人们做了很多工作来评估分泌出来的CXCL12的

5、更新与失活，关于 Cxcl12基因表达调控的方面仍然所知不多。CXCL12的表达在缺氧条件下升高，这是由 HIF-1a结合在其启动子上所致（15）。诸如IL-1好IL-6这样的炎症刺激，以一种CCAAT增强子结合蛋白3 （c/EBP B）依赖性方式诱导 CXCL12表达（16）。另外，Cxcl12启动子区域，除了别的以外，还含有 Sp1，AP1，NFkB, PARP1 结合位点（17 ）。骨形态生成蛋白（BMPs）是中胚层分化的主要调控因子，在造血系统的发育中起重要 作用（ 18， 19）。另外，它们在骨组织的形成与动态平衡中起重要作用，这形成了关键性的 BM 龛（ 20）。 BMPs 可以调

6、控出生后时期的骨动态平衡，并调控骨量来影响成年造血过程， 这一点虽然已经了解得很清楚，但尚不清楚BMP-介导的成骨生物学上的变化是否会直接影响HSPC的功能。以前，人们发现TGF-3可以影响基质细胞系中 Cxcl12的表达（26）。这里，我们揭示了 BM龛中，通过 SMAD依赖性BMP信号转导途径调控 CXCL12的表达，影响了 HSCs的导向与移植成活，也影响造血祖细胞的动员。MATERIAL AND METHODS此处暂略RESULTS系统性抑制SMAD依赖性BMP信号转导途径增强了 HSCs的导向与移植成活为了评估SMAD依赖性BMP信号转导途径在成年造血过程中的作用，我们对经亚致死 量

7、辐射处理过的 CD45.2小鼠静注PBS/NGN°NGN与BMPs结合，抑制其与其受体的结合(34)。 大约 50000 个来自 CD45.1 小鼠的 BM 细胞被移植到经处理后的 CD45.2 小鼠中，以评估在 BMP 信号转导途径发生改变后，移植成活方面是否有任何变化(Fig.1A,1B)。 我们观察到移植后第 4， 8 及 12 周，在未注射 NGN 的原始受体内的供体源性嵌合现象连续增加 。另外， 对继发受体的分析显示，注入 NGN 的小鼠中，长期供体源性的与 BM 的嵌合现象增加了 3 倍。这些研究揭示了SMAD信号转导途径的抑制显著增加了HSCs的长期群体恢复( repo

8、pulation )能力。为了确定注射了 NGN的小鼠中，HSPCs的移植成活增加是否是由导向能力增强所致，所有的BM细胞或lin-细胞被注射到受到致死剂量辐射的动物中，移植后16小时，定居在BM内的克隆形成细胞(CFCs的总数被统计出来，并与注射的CFCs的数量进行比较(Fig.1C)。 植入的CFCs在 BM中定居的比例，在那些NGN处理前的动物中明显更高。 换言之，注射BMP7 而不是BMP4,会引起植入HSCs的导向能力下降。下一步我们检验了注入NGN后，在龛内表达的关键造血调控因子相应的表达情况(Supporti ng In formation Fig.1A)。向小鼠注入PBS/NG

9、N后24小时，用压碎与胶原酶I处理分离出后肢骨中的BM细胞。用MACS分离的lin-CD45BM龛细胞来做qRT-PCR以定量其基因表达情况。在所有被分析的基因中( Cd44, Cxcl12, Icam1 , Vcam1, Mmp7 , Mmp9 , Upa, Ang1 , Opn, Scf,以及 Ccl2),我们发现 Cxcl12 的表达在NGN注射后增加了 2倍(Supporti ng In formation Fig.1A)。我们重复了这些实验， 评估在注射PBS/BMP7/NGN之后，除了 Cxcl12表达之外的SMAD目标基因的表达，以分析 SMAD信号转导途径的状态(Fig.1D)

10、。SMAD目标基因Id2 , Id3,以及Runx2的表达在BMP7 注入后增高了，而与注射 PBS的对照组相比，注射 NGN后的小鼠中，这些目标基因的表达 下降了，这证实了注射的蛋白质对龛细胞中SMAD依赖性BMP信号转导途径的反应性调控(Fig.1D)。另外，注入 BMP7增加了 lin-CD45-BM细胞中SMAD目标基因的表达，而减少了 Cxcl12的表达，这与 NGN注射的结果相反。之后我们测试了注入DM，一种特异性 SMAD磷酸化抑制剂(35),是否会产生类似 NGN的效果。我们观察到注射 DM也能引起lin-CD45BM 细胞中Cxcl12表达的增加(Supporti ng In

11、 formation Fig.1B )。这也伴随着移植后 16小时内定 居在BM中的植入 CFCs比例增加(Supporti ng In formation Fig.1C )。我们也通过对 BM血浆的 ELISA评估了由BM龛细胞分泌的CXCL12蛋白(Fig.1E)。与基因表达结果一致，NGN和BMP7 也影响了 BM血浆中CXCL12蛋白的水平。我们没有发现外周血 CXCL12水平有任何变化(PB; Fig.1F)。在 BM 基质细胞中抑制 SMAD 介导的 BMP 信号转导途径强化了CXCL1的表达由于CXCL12是已知的最重要的将 HSCs趋向到龛中的化学因子， 我们研究其表达程度的

12、改变是否会引起 HSPCs向经过NGN处理的龛中迁移。我们使用了成熟BM基质源性细胞系ST2作为离体模型，用小室转移系统(transwell system )测定迁移(Fig.2A)。我们评估了谱 系耗竭的(lineage-depleted)BM细胞(被PKH-26标记)，向ST2细胞趋化迁移的过程，这 种ST2细胞要么受了 NGN或DM处理，要么就没受处理。DM是一种BMP信号转导途径非常强力的小分子抑制剂，通过选择性抑制 BMP受体I来发挥作用。 用DM抑制BMP信号转导途径引起 HSPCs向ST2细胞迁移(Fig.2A)。增加NGN也使得HSPCs向ST2细胞的趋化过 程增强，提示有信号

13、途径的自分泌调节参与进来。由于静注BMP7抑制了植入HSPC啲导向，我们也分析了 HSPCs向经BMP7处理过的ST2细胞迁移的可能性。但是，和活体中BMP7对 HSPCs定居产生的作用不同，我们没有发现离体条件下BMP7对迁移有任何影响。由于注射 BMP7/NGN造成SMAD信号转导途径改变，并伴有 BM龛中Cxcl12的表达变 化。我们检验了经处理的 ST2中Cxcl12的表达是否也有相同的变化。在有 BMP抑制剂NGN 或DM存在的情况下培养两天，ST2细胞中，Cxcl12的表达与对照组相比，用 qRT-PCR佥测(Fig.2B)。我们观察到ST2细胞中，在SMAD信号途径受到 NGN或

14、DM抑制的情况下，Cxcl12 表达情况显著增高，我们测定了那些受DM或未受DM处理的ST2细胞的上清液中 CXCL12蛋白的水平，进一步扩展了这些发现(Fig.2C)。与基因表达的数据一致，我们发现经DM处理培养的ST2细胞，与对照组相比，CXCL12的分泌水平增高。这些结果被我们做的荧光素酶启动子试验进一步证实，在该试验中，CXCL12启动子被复制到pGL3载体的荧光素酶基因上游( the CXCL12promoter was cloned upstream of the luciferase gene of the pGL3 vector )。 ST2 细胞转染了含有 CXCL12启动子

15、的载体，然后用双重荧光素酶试验来评估受对照载体处理，或受DM/NGN抑制剂处理后荧光素酶的活性(Fig.2D)。NGN和DM都增强了 CXCL12介导的荧光素酶表达，不过NGN的增强效果要弱于 DM。除了 ST2细胞，我们还用原始 BM基质细 胞来做qRT-PCR评估Cxcl12的表达是否受到了 SMAD信号途径改变的影响(Fig.2E)。就像 对ST2细胞的影响那样，用DM或NGN抑制SMAD介导的BMP信号途径，也诱导Cxcl12在 原始 BM 基质细胞中表达增加。这些结果揭示了在那些属于 BM 龛的细胞中，抑制 BMP 信 号途径增强了 Cxcl12的表达。此外，NGN在Cxcl12表达

16、上的作用提示，SMAD介导的BMP信号途径在基质细胞中确实是活化的，这或是由FBS中的BMPs存在所致，或是由这些细胞中的BMPs所致。ST2细胞中Cxcl12的表达受到自分泌形式的调控在我们揭示ST2细胞中SMAD依赖性BMP信号途径的抑制增强了 HSPCs的趋化并增加 了 CXCL12的产量时，通过增加 BMP7进行的刺激在离体情况下却没有这些效果。但是，在 我们的活体研究中，注射 BMP7来系统性诱导 SMAD信号途径，引起了 CXCL12表达和分泌 增加。我们设想这种差异应当归于BM龛细胞和ST2细胞中BMP受体的表达类型不同。为了探究这一问题，我们首先用qRT-PCR评估了 Bmp2

17、, Bmp4, Bmp6, Bmp7，以及Bmp8a 在ST2细胞及原始 BM源性lin 'CD45'细胞中的表达情况(representative of the BM niche)(Fig.3A)。我们发现Bmp4在ST2细胞和BM龛细胞中都是高水平。我们也分析了ST2细胞和龛细胞中不同 BMPR基因的表达(Bmpr1a, Bmpr1b , Acvr1, Acvrl1，以及Bmpr n) (36)(Fig.3B)。我们发现Bmpr1a和Bmpr1b ,已知其对BMP4结合发生反应，在ST2细胞中高表达，但在 Lin-CD45-BM 龛细胞中不是高表达的。因此，这也许解释了为什

18、么我们发现 BMP4 在基于ST2细胞的离体试验系统中有作用，但在全身注射后没有产生这种作用。值得注意的是，尽管BMP7抑制了细胞的导向与 CXCL12的水平，但我们没有发现 ACVR1基因的转录产 物高水平表达，它是 Lin-CD45-龛细胞中BMP7的主要I型受体。用DM和NGN阻断SMAD信号通路，诱导了 ST2细胞中CXCL12的表达，这一观察结果 提示CXCL12的表达受到自分泌形式的调控，这种方式很可能是通过ST2细胞产生的BMP4结合到BMPR1A和BMPR1B受体上实现的，这两种受体都在 ST2细胞内表达。为了进一步证 实这一点，我们使用抗BMP4抗体来中和FBS中的BMP4，

19、或ST2细胞分泌的BMP4，并评估其对Cxcl12表达情况的影响(Supporti ng In formation Fig.2)。我们发现加入针对 BMP4的 中和抗体后，Cxcl12的表达显著增高。我们用核酸内切酶预制的siRNA方法(en do nucleaseprepared siRNA approach ; esi-RNA)做了 Bmp4 和 Smad1 与 Smad5 的敲减(knockdown )研 究，这种方法据报道，与siRNA相比，可以减少非目标基因的影响(38),我们的研究结果确认了上述发现。我们用qRT-PCR和 Western blotting确认了 Bmp4, Sma

20、d1和Smad5的敲减结果(Fig.3C Fig.3D quantitiation in Supporting Information Fig.3)。敲减 Bmp4, Smad1 和 Smad5引起了 Cxcl12表达增高(Fig.3E ,证实了自分泌 BMP4信号途径调控ST2细胞中CXCL12 表达的假设。识别参与调控Cxcl12表达的SMAD结合元件我们在CXCL12基因的转录起始位点上游4kb的一个区域内识别出了 6个SMAD结合元件(SBEs CAGACA或TGTCTG ( Fig.4A)。我们做了 ChIP试验以确定 SMAD4所结合的 CXCL12 启动子中的SBEs哪一个对ST

21、2细胞中的BMP信号转导途径起反应。SMAD4的ChIP试验 使用了剪切的染色质，免疫沉淀DNA被用来充当模板以识别 SMAD4的结合位点，利用的是位于所有 6 个 SBEs旁边的引物(ChIP for SMAD4 using the sheared chromatin was performed and the immunoprecipitated DNA was used as template to identify the binding sites for SMAD4 usi ng primers fla nki ng all 6 SBEs ) (Support ing In for

22、mation table )。对每个 ChIP 试验，都从 IP 信号中减去了同型对照组抗体的信号。 扩增序列的恢复情况以占输入染色质百分比的形式进 行定量。在这6个SBEs之外，我们发现了一个位点，位于起始位点上游2769bp处，在免疫沉淀DNA中显著富集(Fig.4B)。重要的是，添加 DM抑制了 R-SMADs的磷酸化，也抑制了 SMAD4结合到CXCL12启动子中的这个 SBE位点上(Fig.4C)。为了确认这个 SBE位点对SMAD4 结合的重要性, 我们用位点定向诱导突变, 从启动子结构中删除了这段序列。 突变的启动子 被复制到pG13载体中荧光素酶的上游，然后转染到ST2细胞中。

23、荧光素酶试验显示 CXCL12启动子中转录起始位点上游 2769bp处的这个SBEs被删除掉后，阻止了启动子的活化(Fig.4D)。 此外，加入DM或NGN不再影响ST2细胞中CXCL12启动子的功能。因此这些实验证实了 CXCL12的表达受SMAD信号转导途径调控，因为删除SMAD4结合的那个SBE引起Cxcl12的 基础表达水平增高。在BM中刺激SMAD信号转导途径使得 BM龛中Cxcl12表达水平下降，ST-HSC动员由于我们观察到注射 BMP7后，BM血浆内的CXCL12水平下降，我们检验了 HSPCs的 动员是否也受到影响。首先，我们在向小鼠注射PBS或BMP724小时后数出了 BM

24、内原始HSCs的数量，它们的定义是 CD150+CD48-KLS细胞(SLAM KLS ( Fig.5A)。BMP7的注射引起了 BM中原始HSCs出现频率的下降。为了搞清楚外周血中的循环 HSCs是否有任何变化，我 们做了甲基纤维素克隆试验，在注射PBS或BMP7后，数出了外周血中 CFCS的频率（Fig.5B）。我们观察到小鼠注射 BMP7后，外周血中循环 CFCs的频率增高了 4.96 ± 1.53倍（p=0.03 ）。由于BMP7增加了循环CFCs的数量（尽管这种增加比较柔和），我们评估了 BMP7动员 HSPCs以重建遭受致死剂量辐射宿主体内造血功能的能力。从CD45.1小

25、鼠的1ml外周血中得到的MNCs随着PBS或BMP7 一起被静注到遭受致死剂量辐射的CD45.2动物体内，24小时后来自 CD45.2 的 100000 个全 BM 细胞也被移植到该动物体内。每 4 周做一次嵌合分析 （Fig.5C）。4周后，我们观察到在所有移植了细胞的小鼠中，经过BMP7处理的外周血源性细胞移植成活，但在对照组小鼠中没有成活。令人惊讶的是，从第8周以后开始， BMP7 处理过的外周血源性细胞就不再参与造血功能，提示BMP7能动员短期（ST）HSPCs而不是长期（LT）HSCs 16周以后，我们杀死了原始受体小鼠，以分析经BMP7处理过的外周血细胞造成的，或是对照组小鼠外周血

26、细胞中BM造成的细胞恢复情况。我们在经BMP7处理组及对照组中，没有发现任何细胞参与了 BM 造血功能（ Supporting Information Fig.4A ），这证实 了移植的细胞更可能是 ST-HSPCs的假设。有趣的是，对供体源性细胞的多谱系分析表明在 淋巴的移植成活过程中存在偏差。供体源性的B细胞和T细胞所占的比例，都显著高于受体源性的细胞（ Fig.5D,Supporting Information Fig.4B ）。换言之，供体源性细胞的骨髓分化潜能 要低于供体源性细胞。下一步我们检验 BMP7的注射是否会对 BM内的HSCs出现频率，或是对这些细胞中的 CXCR4的表达产

27、生影响，CXCR4的表达也可引起外周血中循环HSPCs比例升高（Fig.6）。我们从注射了 PBS/BMP7的小鼠中获取 BM细胞，然后评估 SLAM KLS细胞上CXCR4的表达情 况（Fig.6A）。我们没有观察到这些细胞上CXCR4的表达情况有任何变化。我们也评估了 HSCs上CXCR4的表达情况，HSCs在有NGN或没有NGN的情况下培养会趋化迁移向ST2细胞（Supporti ng In formation Fig.5 ）。在向经NGN处理的ST2细胞迁移的 HSCs上，与对照组细胞 相比，我们没有发现 CXCR4勺表达情况有任何变化。最后，我们还评估了NGN注射是否对造血祖细胞的出

28、现频率有任何影响，就像对BM内的HSCs一样（Fig.6B-6D）。在注射BMP7后，我们没有发现 HSPCs（lin-c-kit+）, KLS或SLAM KLS细胞的出现频率有任何变化。这排 除了造血祖细胞的动员由BM内HSC的数量增长，或是由这些细胞中CXCR4表达情况改变所致的可能性。BMP7特异性影响BM龛内成骨细胞中 Cxcl12的表达正如我们已经揭示的那样， 在BM龛中的不同细胞类型中删除Cxcl12的表达，影响HSPCs的不同亚型，我们评估了 BM龛中那种细胞内的 Cxcl12的表达受BMP7的注射影响。我们处 死了对照组及 BMP7处理组的小鼠，冲洗后肢骨，用胶原酶I处理，游离

29、出BM细胞。HSC龛的细胞成分，按照表面抗原分成几类，已知这些抗原是表达在这些亚群上的（SupportingIn formation Fig.6，上条）：间质基质/干细胞（lin "CD45CD31"CD51+Sca-1+；间质基质/干细胞 MSCs）,成骨细胞（lin-CD45-CD31-CD51+Sca-1-; OBs）,以及内皮祖细胞（lin-CD45-CD31+;内 皮祖细胞EPCs）如之前发表文献所述（28）。经过分类的细胞，其 RNA被分离出来，然后 用qPCR做扩增并定量测定 CXCL12的表达情况（Fig.7A）。这些研究显示了 EPCs及 MSCs中 Cx

30、cl12的表达情况没有因为 BMP7的注入而发生变化， 而BMP7处理显著降低了成骨细胞中 Cxcl12的表达。利用荧光活化细胞分类（FACS,我们确认了在注射了BMP7的小鼠中，与对照组小鼠相比，成骨细胞（lin-CD45CD31-CD51+Sca-1-）中的CXCL12水平更低（Fig.7B）。 利用I型胶原酶（Col1）充当成骨细胞的标志物也证实了这些结果。Col1特异性抗体被用于识别 lin 'CD45'CD31'CD51+Sca-1'细胞中的成骨细胞群（Supporti ng In formation Fig.6 下条）。我们也利用qRT-PCF和流式

31、细胞技术评估了不同的BMPR基因在成骨细胞中的表达情况（Fig.7C,7D）。从对照组小鼠中获取分了类的成骨细胞，进行qRT-PCR以检测不同BMPR基因的表达情况。我们发现，在所有受分析的I型BMPRs中，Acvrl表达程度最高。我们用流式细胞技术确认了在成骨细胞表面表达ACVR1（Fig.7D）。为了确认BMP信号途径对CXCL12表达的影响一一特别是在成骨细胞中，我们使用了 Col1a1-GFP报导小鼠。首先，我们利用这一系统确认了前述实验中所用的成骨细胞存在表型 标记物。我们发现 73.42 土 4.52%的 Lin-CD45-CD31-CD51+Sca1-BM 细胞也是 Col1a1

32、-GFP阳性的（Supporting Information Fig.7A ），确认了这一表型标记物能够成功地识别出成骨细胞。下一 步，小鼠被注射 PBS或BMP7 , 24小时后，从压碎的骨中用酶消化，获取BM细胞。用流式细胞技术发现 CXCL12在 Col1a1-GFP成骨细胞的表达（Fig.7E。如之前的实验一样，我们观 察到在注射BMP7后，Col1a1-GFP+细胞中CXCL12的表达下降。我们也评估了BMP7的处理是否会引起成骨细胞数量上的任何变化（Fig.7F）。在整个实验期间，我们没有发现注射 BMP7后Col1a1-GFF+成骨细胞的数量，与注射PBS的动物中同类细胞的数量相

33、比，有显著的变化。我们也使用了 BrdU掺入试验来评估成骨细胞的增殖（Supporti ng In formation Fig.7B）。与成骨细胞数量未发生改变的事实一致， 我们没有观察到注射 BMP7/DM 后细胞的增殖状态有任 何变化。因此，BMP信号途径改变对 BM龛内CXCL12表达情况的作用，与成骨细胞绝对数 量的改变无关。因此，我们可以总结，在活体中，注射BMP7后，成骨细胞的 CXCL12的表达情况表现出明显的下降。DISCUSSION尽管对 BMP 信号途径在胚胎造血过程中的巨大作用已经了解得十分清楚，这条途径在 成年造血过程中的作用仍然所知甚少。其他人以及我们揭示了SMAD依

34、赖性BMP信号途径对出生后HSPC的功能不是必需的（33）,因为去除 HSPCs中 SMAD1和SMAD5的表达没有 影响它们在移植后维持造血功能的能力（39）。但是，BMPs存在于BM微环境中，已发现I型BMP受体（BMPRI A）的条件性失活引起成骨细胞和HSPCs的扩张，提示 BMPs对成年造血功能的间接作用（40）。这里，我们揭示了全身性注射 BMP7引起HSCs导向与移植成活能力下降，而注射 NGN 显示出相反的作用。对龛中重要的造血功能调控因子进行筛查，识 别出在lin-CD45-BM细胞（含有所有的 HSC龛细胞）中Cxcl12的表达发生了改变。化学因子 CXCL12介导植入的H

35、SCs趋化迁移到BM龛中，支持它们的导向（9）。在活体中，删除或抑 制CD26, 种裂解CXCL12的酶，会使植入 HSCs的导向与移植成活能力增强（28, 41 ）。通过注射BMP7 （而不是注射 BMP4）活化SMAD信号途径，使 BM龛内Cxcl12表达和 分泌下降。相应地，我们发现了外周血中动员HSCs的数量增加，因为注射 BMP7后血液中CFCs的出现频率增加。被 G-SCF动员的HSPCs广泛用于临床，充当移植来源（42）。在健康 异源干细胞供体中，G-CSF引起的动员效率各异（43）,而动员HSPCs进入患者血液以进行 自体同源移植的能力特别弱（ 44， 45）。实际上，接受过化

36、疗和 /或放疗的患者，有 2025% 的风险不能有效动员HSPCs（46）。人们已经发现在患者中采用的多种动员尝试对其生活质量有不良影响，更不用说治疗的费用了（47）。据报道，像Plerixafor （AMD3100 ）这样的干扰HSPCs与其微环境相互作用的小分子物质，有助于G-CSF介导的动员（48, 49）。Ramirez等人发现BIO5192, VLA-4的一种小分子抑制剂，可以使外周血中HSPCs增加30倍（50）。当与Plerixafor联用时，使HSPC动员的效率增加了 17倍多，这揭示了定位多种动员途径的 重要性。因此，BMP7也可以增强CFC的动员，这一发现可能产生显著的临床意义。我们使用小鼠BM基质源性ST2细胞（还加了 OP9和ac11细胞；数据在本稿中未列出） 充当BM龛细胞的离体模型，来理解 SMAD介导BMP信号途径影响 Cxcl12表达情况的基础过程。已经发现 ST2细胞可以同时支持骨髓形成和淋巴形成（51）。我们发现ST2细胞高表达BMP4，禾U用中和抗体，我们发现BMP4以自分泌SMAD依赖性方式调控 Cxcl12的表达。ST2细胞中的Bmp4或Smad1/5表达敲减实验确认了这一点，该实验引起了 Cxcl12表达增强。有趣的是，ST2细胞分泌的BMP4影响Cxcl12的表达，而在活体中注射 BMP4不会影响