近红外荧光探针尿白蛋白对肾疾病的警告

1、 一种检测尿白蛋白的近红外荧光探针及对肾疾病的警告 摘要肾脏的疾病，包括急性肾损伤、肾病综合征、慢性肾脏疾病，肾囊肿，伴有一系列的临床特点，人血清白蛋白（HSA）是其中肾脏疾病早期预警的重要标志。据我们所知，虽然有报道在血浆中高浓度的HSA的一些HSA荧光探针，多数不能达到低浓度的尿白蛋白的检测灵敏度。在这项工作中，报告了基于TICT机制NIR荧光探针NIR -HSA，它可以用在8.83-fold荧光增强液检测，快速反应（完成5 s内）、高灵敏度（DL 26.16 nm），和优良的稳定性。人尿中检测，近红外HSA显示完美的恢复特性，以及良好的应用潜力检测痕量HSA对危重疾病的警告。1.引言人血

2、清白蛋白（HSA）是已知的在多种生理和病理过程中起到至关重要的作用。通常，HSA功能作为一个无所不在的运输者去传送激素、脂肪酸、药物及其代谢产物和维持血浆胶体渗透压。一般来说，它是产生于肝脏的N-末端肽前白蛋白原。经过一系列从粗糙内质网到高尔基体的加工后，它迅速分泌进入门脉循环。开创性的研究表明血清白蛋白具有三维结构组成的几个结合口袋由于多达67%的二级结构的形成通过六转螺旋。有两个主要的结构选择性结合位点位于HSA的子域IIa和IIIa，点I和点II。当肾脏工作时，有可能是低于30毫克/升的尿液中白蛋白，在血清中的白蛋白含量的参考范围大约是35-50 g/L。但是，越来越多的证据显示，肾损伤

3、后尿中大量的白蛋白渗漏到尿中（例如肾小球滤过功能损伤），它不仅能攻击体液渗透压，而且还与严重疾病有关，例如慢性肾脏疾病，急性肾损伤，肾病综合征，及蛋白丢失性肠病。作为危重病早期预警的重要标志物。虽然很多以前的研究工作是关于HSA的生理功能，在体液中的作用和痕量识别的准确的分子机制还没有克服。因此，充分了解HSA的化学生物学，开发具有复杂生物样品的检测限低的HSA监测准确有效的方法是迫切需要的，尤其是尿，这对生物学研究的重要以及临床诊断是至关重要的。至目前为止，有几种方法来检测体外或体内的血清白蛋白，包括液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）的基础上的蛋白质组学技术，放射免疫测定方法一般临床实

4、验室，电化学和荧光技术分析。在这些技术中，染料结合技术由于操作简单，选择性高，灵敏度高，具有良好的高空间分辨率和时间分辨率，尤其是非破坏性的特点引起了特别的关注。近年来，已经开发了几种荧光探针在体外或体内的血清白蛋白的检测。不幸的是，我们发现，大多数的报告的探针有相当短的激发波长（小于500纳米），发射波长（小于600纳米）和差的检测限（> 30毫克/升），伴随着负面影响，如光漂白，和自体荧光干扰，严重限制了其在复杂的体液检测微量白蛋白的生物应用。此外，大多数探针需要改进热稳定性在长途运输承受高温。因此，它启发我们开发一个近红外（> 650 nm）具有高选择性，灵敏度的荧光探针，H

5、SA的生物样品中识别稳定性和极低的检测限。在我们以前的工作中，通过引入共轭乙烯基增加其发射波长在近红外区域，我们设计并合成了一系列采用基于扭曲的分子内电荷转移（TICT）机制的分子转子的荧光探针，在体外和体内，表现出特定的血清白蛋白检测的近红外光谱发射。由上述的研究，在这项工作中，我们使用半菁染料合成了一种近红外荧光探针NIR-HSA，如图1所示。菁/半菁是一个通过对生色团骨干延伸次亚乙烯基部分的在近红外区长波发射的特色生色团。当NIR-HSA加入HSA的混合系统，通过超快限制扭曲的分子内电荷转移（TICT）得到了近红外（NIR）荧光发射，具有较大的斯托克斯位移（=165 nm）和在发射680

6、 nm左右8.83-fold增强。位移实验分析清楚地表明，对HSA的NIR -HSA的结合位点I。重要的是，对HSA的检测限（3/ K）被计算为26.16纳米（1.73毫克/升），这是优于大多数报道的荧光探针。这个探针表现出良好的热稳定性在PBS缓冲(0.01 M,pH值7.4) 60摄氏度。在107.23-108.79 %范围内得到的RSD为0.09%-1%的良好的回收率，清楚地表明，探针NIR-HSA可以用来检测HSA纯尿液浓度且无干扰。2. 实验部分2.1 基本信息与材料2.2 检测限的确定检测限（DL）的计算是基于NIR-HSA的近红外荧光滴定的，在HSA存在（0-1.0µM

7、）。NIR-HSA的荧光强度是测量三次测量和得到了空白实验的标准偏差。利用检测限计算了检测限，用以下公式计算：DL=3/ K 是空白测量的标准偏差，k是近红外荧光发射强度（F695 nm）与HSA不同浓度之间的斜率2.3 量子产率的确定2.4 NIR-HSA探针在PBS缓冲液中（0.01 M，pH 7.4）的溶解度为了探索探针NIR- HSA的溶解度，在最大吸收uv-vis吸光度采用通过安捷伦科技卡里60 uv-vis分光光度计（序列号my1523004）。以下，最大吸光度绘制不同浓度的HSA的强度。2.5 NIR-HSA检测尿白蛋白2.6 NIR-HSA探针的合成以2-methylbenzo

8、thiazole和碘乙烷合成化合物3。2 -甲基苯并噻唑（500毫克，3.93毫摩尔），乙基碘（620毫克，4毫摩尔），15 mL乙腈回流8 h在N2。冷却至室温，然后乙醚20毫升倒入反应混合物后，用5毫升乙醚洗涤三次，真空过滤机。产量：840毫克（70%）。化合物3的纯度足以下一步。3的混合物（310毫克，1毫摩尔），4（180毫克，1毫摩尔），和乙酸酐（10毫升）回流30分钟，冷却至室温，然后倒入去离子水15毫升进入反应后的混合物，并且产品是用乙酸乙酯萃取，有机层用氯化钠溶液洗。有机层用无水硫酸钠干燥后溶剂挥发干燥，以及由此产生的是黄色的粗产品固体。粗产物经硅胶柱层析得NIR-HSA为黑蓝

9、色固体。产量：300毫克（65%）。Scheme 1. Synthetic procedures of probe NIR-HSA and proposed sensing mechanism for HSA.3. 结果与讨论3.1 NIR-HSA荧光探针的合成NIR-HSA探针可以通过三个步骤类似于以前报道的文献顺利合成，这是显示在细节和特点进行了仔细的核磁共振谱（1H，13C NMR）、高分辨质谱（HRMS）在支持信息部分。此外，该传感机理探针NIR-HSA也证明了Scheme 1.。3.2 光谱研究在PBS缓冲液中（0.01 M，pH 7.4）,NIR-HS

10、A的uv-vis谱表明，最大吸收峰的强度与人血清白蛋白浓度在2-70µM的范围内呈线性增长趋势（Fig. S1），这表明探针NIR-HSA在水溶液中具有良好的溶解性。然后，我们研究了NIR-HSA（10µM）在不同的溶液中的光物理性质。如 Fig. S2 和Table 1所示，最常见的有机溶剂除了二氯甲烷，有基本相同的吸收光谱以及荧光发射光谱也是如此。这类溶剂染料可以作为一个灵巧的区分氯化溶剂和普通有机溶剂（Fig. S3）的化学传感器,由于溶致变色效应和详细报道的半菁染料的电子态。Figure S1 The solubility of NIR-HSA (10 M) in

11、PBS buffer (0.01 M, pH 7.4).Figure S2 The absorbance and emission spectra of NIR-HSA (10 M) in various solutions.Figure S3 The color of probe NIR-HSA (10 M) in various solutions.NIR-HSA包含强烈的“推拉”结构（与氮原子上的正电荷作为电子受体和一个烷基氨基作为电子供体）。这可能意味着，探针NIR-HSA对蛋白微环境的极性变化特别敏感。因此，我们推断，探针可以通过非共价键与蛋白质的结合位点相互作用，导致荧光光谱的巨大

12、变化。单一的NIR-HSA（10µM）探针在PBS缓冲液（0.01 M，pH 7.4）中显示几乎无荧光，可能由于有效的扭曲的分子内电荷转移（TICT）机制不受限制的扭转的部分。在50µM的HSA的加入后，然而，一个显著的近红外荧光信号逐渐增强在680 nm周围，在580 nm的激发（Fig. S4），如预期。Figure S4 The fluorescence spectra of NIR-HSA (10 M) in the presence of 5 equiv HSA with excitation at 580 nm in PBS buffer (0.01 M, pH

13、 7.4).在HSA的加入后，在680 nm处的发射峰迅速增强（Fig. 1a）。当加入100µM的HSA，。这些变化达到一个平稳时期，同时有8.83-fold荧光强度（680 nm）的增强(Fig. 1b)。此外，为了分析NIR-HSA探针（10µM）在PBS 缓冲溶液（0.01 M，pH 7.4）中对HSA的灵敏度，实施了低浓度的HSA的滴定实验(Fig. S5)。满意地，HSA的浓度范围从0.1到1µM，检测限（3/ K）计算为26.16 nm的低（1.73毫克/升）（Fig. 2），近红外荧光强度NIR-HSA探针的近红外荧光强度集中在695 nm良好的线

14、性增加（R2 =0.9978）。这表明探针NIR-HSA具有潜在的能力来定量测定尿中白蛋白HSA浓度的。Fig. 1. (a) Fluorescence spectra changes of probe NIR-HSA (10 M) in PBS buffer (0.01 M, pH 7.4) after incubation with different concentrations of HSA (0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0,

15、 5.0, 6.0, 8.0, 10.0, 15.0, 20.0, 30.0, 50.0, 70.0, 90.0, 95.0, 100.0, 105.0, and 110.0 M). (b) Fluorescence intensity at 680 nm enhancement of NIR-HSA (10 M) as a function of HSA (0120 M) with excitation at 580 nm in PBS buffer (0.01 M, pH 7.4).Fig. 2.&#

16、160;Fluorescence intensity at 695 nm enhancement of NIR-HSA (10 M) as a function of HSA (01.0 M) with excitation at 580 nm in PBS buffer (0.01 M, pH 7.4).Figure S5 Fluorescence spectra changes of probe NIR-HSA (10 M) in PBS buffer (0.01 M, pH 7.4) after incubation

17、with different concentrations of HSA (0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 M) with excitation at 580 nm.3.3 响应速度和pH值的影响在HSA(10 equiv)存在下，探针NIR-HSA（5µM）的时间依赖性(0-450 s)荧光响应表明识别几乎是在5秒内完成(Fig. 3).。这是一个快速反应。随后，我们通过pH滴定法，研究了pH值对NIR -HSA对HSA的识别作用的影响。如Fig. S6,所示，在pH 4.0-9.0范围，探针NIR-HSA的发

18、射显示很小的变化，这意味着，检测和荧光成像不会受到体液pH微环境的干扰。通过比较，NIR-HSA/ HSA分子络合物呈现明显的荧光强度在碱性溶液中（pH 7.0-9.0），这也适用于检测尿中血清白蛋白（pH 5.0-8.0）。我们推测，通过其周围环境的pH值高于蛋白质等电点，HSA的净负电荷增加了，加强了主体和客体之间的静电相互作用。此外，探针NIR-HSA和NIR-HSA/HSA分子络合物在PBS缓冲液（0.01 M，pH 7.4）中，能保持稳定长达70分钟，（Fig. 4），清楚地表明这种探针的生物测定的可能性。Fig. 3. Reaction-time profile

19、s of NIR-HSA (5 M) in the presence of 10 equiv HSA in PBS buffer (0.01 M, pH 7.4). Time range: 090 min, fluorescence signal was collected at 680 nm with excitation wavelength at 580 nmFig. 4. The stability of time dependence of NIR-HSA (10&

20、#160;M) with 10 equiv HSA (black line) or not (red line) in PBS buffer (0.01 M, pH 7.4) were measured with a spectrophotometer every 5 min from 0 to 70 min with excitation at 580 nm. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referre

21、d to the web version of this article.)Figure S6 The influence of pH on fluorescence intensity around 680 nm of NIR-HSA and NIR-HSA/HSA complex in PBS buffer (0.01 M, pH 7.4) with excitation at 580 nm. Black bars represent: probe NIR-HSA(5 M); Red bars represent: NIR-HSA (5 M) + HAS (15 M).3.4 NIR-HS

22、A对HSA的选择性和稳定性为了检验是否NIR -HSA探针能特异性地识别HSA，研究其对HSA和各种生物分析物之间的能力，如各种蛋白质、氨基酸和生物相关的离子。如图Fig. 5 和 Fig. S7,在加入人血清白蛋白，在680 nm处的NIR-HSA /HSA分子络合物近红外荧光强度表现出显著的荧光增强，伴随NIR -HSA / BSA（牛血清白蛋白）分子络合物的干扰，因为他们密切相关的结构和功能。相比之下，在相同条件下，其他的蛋白质包括组蛋白、蛋白酶K、拼贴，溶菌酶，血红蛋白，和胰凝乳蛋白酶只导致轻微的荧光变化，由血清白蛋白在其疏水结合袋内的微结构和微环境引起的。我们还研究了荧光反应对各种氨

23、基酸，如组氨酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸(Fig. S7)，没有明显的干扰，以及各种生物相关的离子(Figs. S8 and S9) 。因此，HSA的相对于其他分析具有很好的选择性表明探针NIR-HSA在复杂生物体系中对HSA检测的应用潜力。Fig. 5. The selectivity of probe NIR-HSA (10 M) toward various analytes. Data shown are for 5 equiv HSA and 0.5 mg/ml fo

24、r all other analytes. All data were obtained after incubation in PBS buffer (0.01 M, pH 7.4) with the analytes at room temperature. Collected emission at 680 nm with excitation at 580 nm.3.5 识别机理深入了解NIR-HSA对HSA的结合特性对更好地理解这种荧光探针的工作原理是非常必要的。进行Jobs plot试验来确认探针NIR-HSA与HSA结合的最大数量。如图6a所示，荧光

25、强度的变化发生了1:1 HSA/NIR-HSA的比率，这表明NIR-HSA / HSA复合物的化学计量比为1:1。这些结果预示着探针NIR-HSA与HSA主要是以一个位点结合。以前的研究工作表明，血清白蛋白有两个主要的选择性结合位点，点I和点II。结合位点I的亲和力主要是通过疏水性相互作用。相反，位点II总是涉及一系列的组合过程，如氢键，疏水性和静电效应。我们使用的是明确的定点药物（如：杀鼠灵用于位点I和布洛芬用于位点II）为了进一步研究NIR-HSA对HSA结合部位通过配体置换策略。如图Fig.S15,NIR-HSA/HSA分子络合物的荧光强度是通过增加了已知的位点I的特定药物加入，诱导明显

26、下降，而添加布洛芬几乎没有影响。所以，位移实验分析清楚地表明，NIR-HSA对HSA的结合位点是位点I。由于探针NIR-HSA存在不受限制的扭转旋转的部分，在PBS缓冲液中（0.01 M，pH 7.4）TICT发射很弱，这可以合理考虑TICT态的性质。当HSA加入混合系统，探针NIR-HSA进入有低极性和较强的空间位阻的疏水空腔的HSA中。随着空间位阻的增加，共轭链中C-C单键和在供体基团C-N单键的旋转受阻，这抑制了从局部激发态到TICT态的转变。因此，探针NIR-HSA / HSA络合物的荧光强度得到明显增强。这种现象是很好的解释我们的上述试验结果和温度(Figs. S10-12）和粘度（Figs. S13-14）的影响也证实了TICT机制。此外，NIR-HSA与HSA结合前后的寿命进行实验。在人血清白蛋白的情况下，探针NIR -HSA显示T1¼0.104 ns的荧光寿命（95.47%）和T2¼0.104 ns（95.47%）。buffter后加入HSA到 PBS缓冲液中（0.01 M，pH 7.4），NIR-HSA分子络合物显示较长的荧