秋茄实验方法与步骤

1、胁迫前将秋茄苗（半年）从花盆中取出，先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水和超纯水清洗，用滤纸擦干后放入装有4L胁迫液（浓度分别为0，0.2；1；10；50ppm的Hg2+）的桶中胁迫5天，每桶5-10株幼苗。每处理重复三次，共计15盆，约150棵幼苗。测定指标：一、幼苗叶片中Hg的分级 二、植物体内汞形态分析 三、叶绿素含量的测定 四、抗氧化酶的测定 五、丙二醛含量的测定 六、植物络合素的测定（GSH和NPT）具体方法步骤如下：一、幼苗叶片中Hg的分级将叶片清洗干净后（自来水+蒸馏水+超纯水），取1g叶片去除叶脉，在-3.5Kpa的压力下，用3mlpH6.5的50mM MES-Tris缓冲液真空抽滤

2、渗透2次，滤液至于锥形瓶中,中间放气1次（大于2min），然后在85ml?美国进口的离心管（15ml离心管）中4000g，4度下离心15min，得到上清液即质外体汁液，将上清液转移至试管（依据量的多少看定容到多大容量瓶）中测定汞含量。将残叶于-20度冰箱冷冻2天，自然解冻后，于15ml离心管中4000g，4度下离心15min，然后用乙醇洗涤残叶离心收集汁液，重复2次，合并3次获得的汁液为共质体组分，最后残渣部分为细胞壁。细胞壁成分用硝酸消解后测定汞含量（pH6.5的50mM MES-Tris缓冲液的配置：MES= 2-(N-吗啡啉）乙磺酸；Tris=三羟甲基氨基甲烷；用NaOH调节pH至6.5

3、，PH计)二、植物体内汞形态分析 参照许嘉琳等的方法，作物体内重金属形态分析采用新鲜样品,以避免在放置过程中重金属的形态发生变化.样品采集后立即洗净,剪成1-2m m2 细块,并开始采用逐步分离法,分别提取根、叶中的重金属.主要操作方法如下: 对植物体内不同形态重金属进行逐步提取。提取剂及顺序依次为：( 1 ) 8 0 乙醇：提取以硝酸盐， 氯化物为主的无机盐以及氨基酸盐等。( 2) 去离子水：提取水溶性有机酸盐， 重金属的一代磷酸盐等。( 3 ) 1mol/L氯化钠溶液：提取果胶 酸盐，与蛋白质结合或呈吸着态的重金属等。( 4) 2醋酸：提取难溶于水的重金属磷酸盐，包括二代磷酸盐，正磷酸盐等

4、。 ( 5) 0.6 mol/L 盐酸：提取草酸盐等。 提取方法：准确称取 2.00g 鲜样置于烧杯中，加入 20 mL提取剂， 使样品保持浸透状态， 并在 30恒 温箱内放置 18 h后回收提取液。再在放置样品的烧 杯中加入同样体积的同样提取剂,浸取 2 h后再回收提取液， 并连续再重复提取 2次，即在 24 h内共进行 4次提取。集 4次提取液于烧杯中测定其汞含量。每换不同的提取剂前用80%的乙醇清洗烧杯和残叶三遍，用镊子小心将残叶夹在滤纸上，待液体几乎吸收完全后，再加入下一步提取剂。这样重复进行。最终将置于烧杯中最后残叶硝酸消解残渣测定汞含量。三、叶绿素含量的测定 混合液的配置：用纯丙酮

5、、无水乙醇和蒸馏水按4.5:4.5:1的比例配成混合液备用。叶绿素浸提：选取新鲜成熟叶片，去除中脉剪碎混匀，称取约0.15 g叶片放入15mL 离心管中，加入10mL混合备用液，振荡后避光保存。当观察到叶片组织变白时，进行光密度测定。叶绿素含量测定：取3mL叶绿素叶绿素浸提液，盛入10mm比色皿中，用混合液作对照。用分光光度计测定645nm和663nm的光密度值，根据以下公式计算叶绿素含量：Ca（mg/g）=12.7×OD6632.69×OD645 ×V÷1000÷WCb（mg/g）=22.9×OD6454.86×OD663

6、 ×V÷1000÷WCa+b（mg/g）=8.02×OD663+20.20×OD645(2.3) ×V÷1000÷WV是浸提液的最终体积 W是叶片鲜重四、抗氧化酶的测定4.1酶液的提取 分别取相对稳定的1g叶片和根尖样品，剪碎，在预冷的研钵中分次加入0.05 mol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）5ml以及少量的PVP和少量石英砂于冰浴下研磨,转移至15ml离心管中，再用5ml缓冲液清洗研钵中的残余。匀浆在高速冷冻离心机上419000×g离心10min，上清液用于酶系活性测定。（提取的酶液即为10ml）

7、4.2可溶性蛋白含量测定 按照李合生等的方法用考马斯亮蓝G-250进行染色，在波长为595nm处进行比色。用牛血清蛋白作为标准蛋白。试剂:标准蛋白质溶液:100g/mL牛血清白蛋白:称取牛血清白蛋白25mg,加水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40mL,用蒸馏水稀释至100mL即可。考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90%乙醇中，加入100mL 85%（w/v）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。仪器：722分光光度计，研钵，烧杯，量瓶，移液管，具塞刻度试管标准曲线制作表试管号123456蛋白标准溶液/ml00.200.

8、400.600.801.00蒸馏水量/ml1.000.800.600.400.200考马斯亮蓝/ml555555蛋白质含量/g020406080100（1）标准曲线制作：取6支具塞试管按表所列加入各试剂，摇匀。放置3min，用1cm光径比色皿在595nm波长比色。以牛血清蛋白含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲（2）样品测定：取酶提取液40l，置于具塞试管中，加入pH7.8的磷酸缓冲溶液至总体积为1ml，加入5 ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置3min。595 nm波长比色，比色反应在1 h内完成。（3）计算：根据样品提取液的吸光度，从标准曲线中查出相应的蛋白质含量，按下式计算样品中蛋白质

9、含量。P=（C×V）/（W×Vt）C-查得的蛋白质含量（由标准曲线求得），g；V-提取液总体积，ml；Vt-测定时所吸取的体积，ml；W-样品重，g；P -蛋白质含量（鲜重），g/g。4.3超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用氮蓝四唑（NBT）法测定。试剂：0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.8）130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml750mol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。100mol/L EDTA-Na2 溶液：称取0.03721g EDTA-Na

10、2,用磷酸缓冲液定容至1000ml。20mol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存仪器：高速台式离心机，分光光度计，荧光灯（反应试管处照度为4000lx）显色反应：取5ml透明度好的指形管4支，2支为测定管，2支为对照管，按下表加入各溶液。混匀后，将1支对照管放置在暗处，其他各管于4000lx日光下反应20min。SOD活性测定：反应结束后，用黑布罩于其他试管，终止反应，以不照光的对照管作为空白，分别在560nm波长下测定各管的吸光度，计算其活性。各溶液显色反应用量试剂（酶）用量/ml终浓度/比色时0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L

11、 甲硫氨酸溶液0.313mmol/L750mol/L 氮蓝四唑溶液0.375mol/L100mol/L EDTA-Na2 溶液0.310mol/L20mol/L 核黄素溶液0.32.0mol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0已知SOD活性单位以抑制NBT光化学还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD活性=2（ACK-AE）×V/ACK×W×Vt(2.7)；SOD比活力=SOD活性/蛋白质含量(2.8)ACK-照光对照管的吸光度；AE-样品管的吸光度；V-样品液的总体积，mL；Vt-测定时样品用量mL；W-样品

12、鲜重，g.SOD活性单位U/g FW，蛋白质含量单位为mg/g，SOD比活力单位为U/mg蛋白。4.4过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法测定。反映混合液:100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）50ml，加入愈创木酚28l，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19l，混合均匀，保存于冰箱中。酶活性的测定：取光径1cm比色皿2只，于一只中加入反应混合液3.9ml，KH2PO40.1ml，作为校零对照，另一只中加入反应混合也3.9ml，酶液0.1ml，立即开启秒表计时，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次。以每分钟OD变化值

13、表示酶活性大小。活性单位（U）。POD活性=A470×1000/P×V×0.01u/mg Pro（2.9)A470-1 min内吸光度的变化；P-蛋白浓度，g/mLV-取用酶液体积，mL。五、丙二醛含量的测定参照赵世杰等方法测定。选取新鲜成熟叶，去除中脉剪碎混匀称取0.5 g样品，加入3ml 10TCA和少量石英砂，研磨至匀浆；匀浆在4000 r/min离心10 min。取上清液2ml（对照组2ml H2O），加入2ml 0.6%TBA混匀，混合物于沸水浴中煮沸15min，迅速冷却后在4000 rpm，4，离心20min。取上清液测定OD532、OD600、OD4

14、50。六、植物络合素的测定6.1谷胱甘肽含量的测定【器材与试剂】研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计50g/L三氯乙酸溶液（含5mmol/L Na2-EDTA）:称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶解至100ml。再称取186mgNa2-EDTA.2H2O，加入到100ml 50g/L三氯乙酸溶液中溶解。0.1mol磷酸钠缓冲液（PH7.7）0.1mol磷酸钠缓冲液（PH6.8）4mmol/L的DTNB溶液：称取15.8mgDTNB，用0.1mol/L、PH6.8的磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4保存，现用现配。10

15、0mol/L还原型谷胱甘肽标准液：称取3.1mg还原型谷胱甘肽，加入少量无水乙醇溶解，加蒸馏水定容至100ml。【实验步骤】1. 标准曲线制作取6支试管编号，按下表加入各种试剂，混匀，25保温反应10min。以0号管为参比调零，测定显色液在波长412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量为横坐标，绘制标准曲线。 试管号项目 0 1 2 3 4 5 100mol/L还原型谷胱甘肽标准液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 00.1mol/LpH7.7磷酸缓冲液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.04mm

16、ol/LDTNB试剂/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5相当于还原型谷胱甘肽物质的量/mol 0 20 40 60 80 1002. 提取称取1g样品于研钵中，加入5ml经4预冷的50g/L三氯乙酸溶液（含5mmol/L Na2-EDTA），在冰浴条件下研磨成匀浆，于4、19000g离心15min（15ml离心管）。收集上清液用来测定谷胱甘肽含量，测量提取液总体积（V？）。3. 测定取1支5ml离心管，依 次加入1mL蒸馏水、1ml0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.7）和0.5ml 4mmol/LDNTB溶液，混匀，即为绘制标准曲线的0号管液。以此溶液作为参比，在波长412

17、nm处对分光光度计进行调零。 另取2支试管，分别加入1ml（Vs）上清液、1ml0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.7）。向一支试管中加入0.5ml 4mmol/LDNTB溶液，另一支试管加入0.5ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（PH6.8）。将2支反应管置于25保温10min。按照标准曲线的方法，迅速测定显色液在波长412nm处的吸光度，分别记作ODS和odc。【结果计算】显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度（ODs）和空白对照管反应混合液的吸光度（ODc）.根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量（n），计算其含量(mol/g)。 还原型谷胱甘肽含量（mol/g）=

18、(n×V)/(Vs×m)m为样品质量【注意事项】 1. 在提取样品时，需要沉淀出去蛋白质，以防蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。2. 建议在第一次测定时先做2或3个样品本底对照，如果样品本底对照和空白对照非常接近，则说明样品液中不存在干扰物质，可以不再检测样品本底对照。6.2 NPT 含量测定1.标曲的制定同上 2. 称取植物样品1g， 加入2mL5%的 SSA（5-磺基水杨酸）低温（冰上）下研磨(研钵)，冰浴30min,移至15ml离心管中8,000g4摄氏度离心15min， 取上清液0.2mL， 加入2mL的0.2 mol L1Tris-HCl和0.3mL?0.15ml10mmolL1DTNB(二硫代双-二硝基苯甲酸)于5ml离心管中，30水浴（水浴锅） 20min后，在 412nm下测定分光测定(紫外分光光度计)测定方法GSH.实验所需药品：氯化锌 氯化汞 纯丙酮