生物化学实验课件1(动态)

1、生物化学实验生物化学实验河南工业大学生物工程学院河南工业大学生物工程学院生物技术系生物技术系 2015.3 Henan University of Technology实验内容实验内容1.淀粉含量测定淀粉含量测定2.氨基酸的纸上层析氨基酸的纸上层析3.蛋白质分子量测定蛋白质分子量测定4.淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定 5.蛋白质含量测定蛋白质含量测定6.甲醛滴定测氨基氮甲醛滴定测氨基氮 7.酵母酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定的提取、组分鉴定和含量测定8. 赖氨酸含量测定赖氨酸含量测定9. 凝胶层析法分离蛋白质凝胶层析法分离蛋白质10. 蔗糖酶的提取与部分纯化蔗糖酶的提取与部分纯化11. 蔗

2、糖酶活力的测定蔗糖酶活力的测定12. Bradford法测定蛋白质含量法测定蛋白质含量教学目的教学目的 生物化学是专业基础实验课，其生物化学是专业基础实验课，其先修课程为先修课程为无机化学、分析化学和有机化学无机化学、分析化学和有机化学 。其目的是：。其目的是：学习和掌握生物技术，培养动手观察和思维能学习和掌握生物技术，培养动手观察和思维能力。力。学习方法学习方法1 1、预习：实验前必须进行充分的预习和准备，并写出预习报告，做到心预习：实验前必须进行充分的预习和准备，并写出预习报告，做到心中中有数，这是做好实验的前提有数，这是做好实验的前提。2 2、操作：应按拟定的实验操作计划与方案进行。做到

3、轻（动作轻、讲话操作：应按拟定的实验操作计划与方案进行。做到轻（动作轻、讲话轻），细（细心观察、细致操作），准（试剂用量准轻），细（细心观察、细致操作），准（试剂用量准确确、结果及其记录、结果及其记录准确），洁（使用的仪器清洁，实验桌面整洁，实验结束把实验室打扫准确），洁（使用的仪器清洁，实验桌面整洁，实验结束把实验室打扫清洁）。清洁）。3 3、在实验全过程中，应集中注意力，独立思考解决问题。自己难以解释时在实验全过程中，应集中注意力，独立思考解决问题。自己难以解释时可请老师解答。可请老师解答。4 4、写实验报告：做完实验后，应解释实验现象，并作出结论，或根据实验写实验报告：做完实验后，应解释

4、实验现象，并作出结论，或根据实验数据进行计算和处理。主要包括：数据进行计算和处理。主要包括：a a、目的，、目的，b b、原理，、原理，c c、操作步骤及、操作步骤及实验性质、现象，实验性质、现象，d d、数据处理（含误差原因及分析），、数据处理（含误差原因及分析），e e、讨论讨论，f f、思考题回答。思考题回答。实验室守则实验室守则生物化学实验室守则是学生实验正常进行的保证，学生进入实验室必须遵守生物化学实验室守则是学生实验正常进行的保证，学生进入实验室必须遵守以下规则：以下规则：1. 进入实验室，须遵守实验室纪律和制度，听从老师指导进入实验室，须遵守实验室纪律和制度，听从老师指导 2.

5、未穿实验服、未写实验预习报告者不得进入实验室进行实验。未穿实验服、未写实验预习报告者不得进入实验室进行实验。3. 进入实验室后，要熟悉周围环境，熟悉防火及急救设备器材的使用方法和存放位置，进入实验室后，要熟悉周围环境，熟悉防火及急救设备器材的使用方法和存放位置，遵守安全规则。遵守安全规则。 4. 实验前，清点、检查仪器、明确仪器规范操作方法及注意事项，否则不得动手操作。实验前，清点、检查仪器、明确仪器规范操作方法及注意事项，否则不得动手操作。 5. 使用药品时，要求明确其性质及使用方法后，据实验要求规范使用。禁止使用不明确使用药品时，要求明确其性质及使用方法后，据实验要求规范使用。禁止使用不明

6、确药品或随意混合药品药品或随意混合药品。6. 实验中，保持安静，认真操作，仔细观察，积极思维，实验中，保持安静，认真操作，仔细观察，积极思维，实验过程中必须有原始记录实验过程中必须有原始记录，不得擅自离开岗位。不得擅自离开岗位。7. 实验室公用物品（包括器材、药品等）用完后，应归放回原指定位实验室公用物品（包括器材、药品等）用完后，应归放回原指定位置。置。实验废液、废实验废液、废物按要求放入指定收集器皿。物按要求放入指定收集器皿。8. 爱护公物，注意卫生，保持整洁，节约用水、电、气及器材。爱护公物，注意卫生，保持整洁，节约用水、电、气及器材。9. 实验完毕后，要求整理、清洁实验台面，检查水、电

7、、气源，打扫实验室卫生。实验完毕后，要求整理、清洁实验台面，检查水、电、气源，打扫实验室卫生。 10. 实验记录经教师签名认可后，方可离开实验室。实验记录经教师签名认可后，方可离开实验室。 实验一淀粉含量测定实验一淀粉含量测定一、实验目的一、实验目的1.掌握旋光仪的操作使用。掌握旋光仪的操作使用。 2.了解旋光法测粗淀粉的基本原理。了解旋光法测粗淀粉的基本原理。二、实验原理二、实验原理 v在加热及稀盐酸的作用下，淀粉水解并转入盐酸溶在加热及稀盐酸的作用下，淀粉水解并转入盐酸溶液中。在一定的水解条件下，不同谷物淀粉的比旋液中。在一定的水解条件下，不同谷物淀粉的比旋光度是不同的。其在光度是不同的。

8、其在171195之间，因此可用旋之间，因此可用旋光法测定粗淀粉的含量。光法测定粗淀粉的含量。三、实验仪器和试剂三、实验仪器和试剂1、主要、主要仪器：仪器：（1）旋光仪旋光仪（2）电子）电子天平（感量天平（感量0.0001g）2、试剂：试剂： 1盐酸溶液盐酸溶液 30硫酸锌溶液。硫酸锌溶液。 15亚铁氰化钾溶液。亚铁氰化钾溶液。四、实验步骤四、实验步骤1.样品的处理样品的处理 在电子天平上称取小麦粉在电子天平上称取小麦粉2.5000g置于三角瓶中置于三角瓶中加入加入50ml 1%HCl混成浆状（不能有结块）混成浆状（不能有结块）沸水浴中准确加热沸水浴中准确加热15min先加先加1ml 30% Z

9、nSO4混匀混匀再加再加1ml 15%亚铁氰亚铁氰化钾混匀化钾混匀移至移至100ml容量瓶中加水定容混匀后过滤容量瓶中加水定容混匀后过滤弃去弃去最初最初15ml收集其余滤液收集其余滤液。2.旋光度测定旋光度测定 取滤液取滤液20ml置于旋光管中，先用置于旋光管中，先用1%HCl 调节旋光仪调节旋光仪“0”点，点，然后将样品溶液放入旋光仪中测然后将样品溶液放入旋光仪中测v五五 、 结果计算结果计算 100.10020WLD淀粉含量（） ）：样品质量（gdm27 .18220WLD其中其中：六、思考题六、思考题v样品加盐酸处理时，煮沸时间少于或多于样品加盐酸处理时，煮沸时间少于或多于15min会对

10、测定会对测定结果产生什么影响？结果产生什么影响？实验二实验二氨基酸的纸上层析氨基酸的纸上层析一、实验目的一、实验目的 通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。法。二、实验原理二、实验原理 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的OH具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经

11、支持物时层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。分离。三、仪器和试剂三、仪器和试剂1、主要、主要仪器：仪器：（1）层析缸）层析缸（2）微量进样器微量进样器（3）喷雾器）喷雾器2、试剂试剂 ：（1）展）展开开剂：剂：乙醇：水：冰乙酸乙醇：水：冰乙酸50:10:1 （2）氨基酸溶液：）氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、的赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸苯丙氨酸溶溶液及它们的混合液液及它们的混合液 （3）显色剂：）显色剂：0.1%水合茚三酮丙酮溶液。水合茚三酮丙酮溶液。四、实验步骤四

12、、实验步骤1、平衡：将展开剂（乙醇：水：冰乙酸、平衡：将展开剂（乙醇：水：冰乙酸50:10:1）放入培养）放入培养 皿中置于密闭容器内使其充满展开剂（皿中置于密闭容器内使其充满展开剂（24h左右）左右）2、点样：取滤纸、点样：取滤纸1张用铅笔在距下方张用铅笔在距下方2cm处划线并将所得线段处划线并将所得线段分成分成5等分从而得到等分从而得到4个标记点，用微量进样器分别取个标记点，用微量进样器分别取5l下列样下列样品品phelyspro混合混合Aa向向4个标记点上加样（样品扩散中个标记点上加样（样品扩散中1cm）3、展层：将滤纸卷成筒状且不能够重叠、展层：将滤纸卷成筒状且不能够重叠，并用棉线扎紧

13、然后并用棉线扎紧然后垂直放入培养皿中进行展层垂直放入培养皿中进行展层2h（当展开剂沿到达滤纸长度三分（当展开剂沿到达滤纸长度三分之二时，即可取出）测量展开剂前沿移动距离（之二时，即可取出）测量展开剂前沿移动距离（a）4、显色：用、显色：用0.1%茚三酮茚三酮-丙酮溶液朝点样面喷雾（不要喷得太丙酮溶液朝点样面喷雾（不要喷得太多）然后将滤纸置于电炉上方多）然后将滤纸置于电炉上方20cm处加热直至斑点出现为止，处加热直至斑点出现为止，测量各斑点中心到点样点距离（测量各斑点中心到点样点距离（b）v1计算出各种氨基酸的计算出各种氨基酸的Rf值，并根据值，并根据Rf值鉴定出混值鉴定出混合氨基酸中的各组分，

14、在层析图谱上标出各氨基酸合氨基酸中的各组分，在层析图谱上标出各氨基酸名称。名称。v2对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。五、结果计算五、结果计算六、思考题六、思考题）展开剂前沿移动距离（）（斑点中心到点样点距离abR f实验三蛋白质分子量测定实验三蛋白质分子量测定一、实验目的一、实验目的 掌握电泳基本原理、分类、影响因素掌握电泳基本原理、分类、影响因素, SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳用途凝胶电泳用途,凝胶制备凝胶制备。二、实验原理二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质相对分子质量）测定蛋白质相对分子质量的方法，主要

15、是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所的方法，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 在聚丙在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），），使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主间原有的电荷差异消失，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小。当蛋白质的分子量在要取决于它的分子量大小。当蛋白质的分子量在15000

16、200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系。三、仪器和试剂三、仪器和试剂1主要仪器主要仪器（1）电泳仪电泳仪（2）电泳槽电泳槽2. 试剂试剂（1）电极缓冲液）电极缓冲液（2） PH 7.2 凝胶缓冲液凝胶缓冲液（3）1%TEMED，（4）30%凝胶液，凝胶液，（5）10%过硫酸铵过硫酸铵（6）0.1%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染色液染色液（4）10%乙酸乙酸脱色液脱色液四、实验步骤四、实验步骤1. 电泳槽的安装：取两块玻璃板电泳槽的安装：取两块玻璃板将带玻璃条的板（高板）放置桌面上将带玻璃条的板（高板）放置桌面上在上面放置在上面放置“U”

17、型橡胶条型橡胶条最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置于电泳槽内，用锲子压紧。于电泳槽内，用锲子压紧。2. 凝胶液的制备与灌装：配置凝胶液的制备与灌装：配置20ml凝胶液：在小烧杯中依次加入凝胶液：在小烧杯中依次加入5ml 30%凝胶液，凝胶液，10ml PH 7.2 凝胶缓冲液，凝胶缓冲液，2ml 1%TEMED，2.2ml重重蒸蒸水，水，0.8ml 10%过硫酸铵混匀过硫酸铵混匀立即沿高板内侧倒凝胶液于两板之间直至低立即沿高板内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿板上沿插上梳子插上梳子400C放置放置15min，待胶凝后取下，待胶凝后取下“U”条条重新将胶

18、板重新将胶板放置于电泳槽内放置于电泳槽内向外槽内加三分之一槽深电极缓冲液向外槽内加三分之一槽深电极缓冲液向内槽加入电向内槽加入电极缓冲液没过低板极缓冲液没过低板最后拔出梳子。最后拔出梳子。3. 加样：用微量进样器加入加样：用微量进样器加入7l标准蛋白于中间胶槽内标准蛋白于中间胶槽内其余槽内加入其余槽内加入7l下列样品牛血清蛋白绿豆分析蛋白下列样品牛血清蛋白绿豆分析蛋白4. 电泳：连接电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，打开电源电泳：连接电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，打开电源调电流调电流120mA电泳电泳2h（当指示剂前沿超过二分之一胶长时停止）（当指示剂前沿超过二分之一胶长时

19、停止）5. 剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液量取指示剂迁移距离和染色剂的前胶量取指示剂迁移距离和染色剂的前胶长，然后将胶板置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板距离长，然后将胶板置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板距离6. 染色与固定：将胶板放入染色盒内染色与固定：将胶板放入染色盒内向其中加入向其中加入0.1%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250使使其浸没置于摇床上染色过夜其浸没置于摇床上染色过夜(12h)7. 脱色：用脱色：用10%乙酸溶液脱色至谱带清晰乙酸溶液脱色至谱带清晰(48h)，测定脱色后胶长及各谱带，测定脱色后胶长及各谱带迁移距离。迁移距离。五五 、 结果计算结果

20、计算1、计算相对迁移率：、计算相对迁移率：2、以相对迁移率为横坐标、以相对迁移率为横坐标、LgMR为纵坐标，为纵坐标，作出分子量标准曲线。作出分子量标准曲线。3、求分子量、求分子量指示剂示剂迁移蛋白质白质迁移MR相对对迁移脱色后胶长染色前胶长）（五、注意事项五、注意事项v130%Acr-Bis是神经毒化合物，操作时要小心，做好个是神经毒化合物，操作时要小心，做好个人防护人防护v2过硫酸铵需现用现配过硫酸铵需现用现配v3过硫酸铵和过硫酸铵和TEMED在灌胶前加入即可在灌胶前加入即可v4用微量加样器上样时，勿刺破胶面用微量加样器上样时，勿刺破胶面 根据本实验所学知识，自行设计豌豆凝集素的分离纯化实

21、验。根据本实验所学知识，自行设计豌豆凝集素的分离纯化实验。六、思考题六、思考题实验四淀粉酶活力测定实验四淀粉酶活力测定 一、实验目的一、实验目的 学习和掌握测定淀粉酶（包括学习和掌握测定淀粉酶（包括-淀粉酶和淀粉酶和-淀粉酶）活力淀粉酶）活力的原理和方法。的原理和方法。二、实验原理二、实验原理 淀粉酶主要包括淀粉酶主要包括-淀粉酶和淀粉酶和-淀粉酶两种。淀粉酶两种。-淀粉酶可机淀粉酶可机作用于淀粉中的作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖三糖、糊精等还原糖，-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，

22、行水解，生成生成麦芽糖。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使麦芽糖。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基氨基-5-硝基水杨酸硝基水杨酸。其反应如其反应如右图右图：淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。的麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于萌

23、发后的禾谷类种子中，其中主要是淀粉酶存在于萌发后的禾谷类种子中，其中主要是-淀粉酶淀粉酶和和-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热，在淀粉酶不耐热，在7015min钝化。钝化。根据它们的这种特性，采用加热的方法钝化根据它们的这种特性，采用加热的方法钝化-淀粉酶，测出淀粉酶，测出-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（-淀粉酶淀粉酶活力活力+-淀粉酶活力），再减去淀粉酶活力），再减去-淀粉酶的活力，就可求出淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的

24、活力。淀粉酶的活力。三、仪器和试剂三、仪器和试剂v主要主要仪器：仪器：v（1）离心机）离心机v（2）分光光度计）分光光度计v试剂试剂v（1）标准麦芽糖溶液（）标准麦芽糖溶液（2mg/mL）v（2）1%3,5-二硝基水杨酸试剂二硝基水杨酸试剂v（3）1%淀粉淀粉四、操作步骤四、操作步骤以麦芽糖含量以麦芽糖含量（mg）为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。1标准曲线的制作标准曲线的制作（每（每2组组4人做人做1标准曲线）标准曲线） 2. 淀粉酶液的制备：淀粉酶液的制备： 在电子天平上称取小麦芽（在在电子天平上称取小麦芽（在9428冰箱内，用后放回）冰箱内，

25、用后放回）0.5g置于研钵中置于研钵中加加20ml水研成浆状水研成浆状转移至离心管中转移至离心管中2000转转/分离心分离心5min（注意离心前（注意离心前对称放置的离心管应在天平上平衡）对称放置的离心管应在天平上平衡）取上清液于取上清液于100ml容量瓶中加水容量瓶中加水定容混匀定容混匀即得淀粉酶原液即得淀粉酶原液用于用于-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定 吸取原液吸取原液5ml于于100ml容量瓶中加水定容即得淀粉酶稀释液容量瓶中加水定容即得淀粉酶稀释液用于总酶活用于总酶活力测定。力测定。3. 淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定 -淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定 吸取原液吸取原液1ml于具塞试管中于具

26、塞试管中70保温保温15min用于钝化用于钝化-淀粉酶淀粉酶加加1ml 1%淀粉置于淀粉置于40水浴中保温水浴中保温5min加加1% 3.5一二硝基水杨酸一二硝基水杨酸2ml 沸水沸水加热加热5min后加水至后加水至20ml混匀测混匀测A1用用1#管调零管调零 总酶活力测定总酶活力测定 吸取稀释液吸取稀释液1ml于具塞试管中于具塞试管中加加1ml 1%淀粉淀粉40保存保存5min加入加入1% 3.5一二硝基水杨酸一二硝基水杨酸2ml沸水加热沸水加热5min后加水至后加水至20ml混匀测混匀测A2用用1#管调管调零零 五、结果计算五、结果计算-淀粉酶活力（淀粉酶活力（）淀粉酶总活力）淀粉酶总活力

27、-淀淀粉酶活力粉酶活力六、附六、附 注注v1样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。料酶活性的大小而定。v2为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入时取出试管，立即加入3,5-二硝基二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴

28、温度变化应不超过同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过0.5。v3如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。七、思考题七、思考题v1为什么要将试管中的淀粉酶原液置为什么要将试管中的淀粉酶原液置70水浴中水浴中保温保温15min？v2为什么要将各试管中的淀粉酶原液和为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉淀粉溶液分别置于溶液分别置于40水浴中保温？水浴中保温？实验五蛋白质含量的测定实验

29、五蛋白质含量的测定一、实验目的一、实验目的 学习凯氏定氮法的原理和操作技术。学习凯氏定氮法的原理和操作技术。二、实验原理二、实验原理 含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子

30、浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，降低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。测物中的总氮量。二、实验原理二、实验原理 含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。用生成硫酸铵。 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽浓碱可使消化

31、液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。量。三、实验试剂、器材三、实验试剂、器材1主要仪主要仪器器v(1)凯氏定氮蒸馏装置凯氏定氮蒸馏装置v(2)消化炉消化炉v(3)电子电子天平天平

32、2试剂试剂v(1)浓硫酸（化学纯）浓硫酸（化学纯）v(2)硫酸钾硫酸钾-硫酸铜混合硫酸铜混合催化剂催化剂v(3)甲基红甲基红-溴甲酚绿混合指剂溴甲酚绿混合指剂v(4)2%硼酸溶液硼酸溶液v(5)标准盐酸溶液（约标准盐酸溶液（约0.01mol/L）v(6)40%NaOHv(7)0.01mol/L HCl四、操作步骤四、操作步骤v1、消化：在电子天平上称取小麦粉、消化：在电子天平上称取小麦粉0.2000g-0.4000g 置于凯氏试管底部置于凯氏试管底部加加混合混合催化剂混合混合催化剂0.5g和和3ml浓硫酸置于消化炉中高温加热至淡绿色透明（浓硫酸置于消化炉中高温加热至淡绿色透明（2h左左右）取出

33、放入通风橱内至不冒白烟，向其中加右）取出放入通风橱内至不冒白烟，向其中加20ml水，并移至水，并移至100ml容量瓶定容量瓶定容容即得样品消化液。即得样品消化液。v 同时每同时每4组组8人做人做1空白实验：空白实验：0.5g混合催化剂混合催化剂+3ml浓硫酸置于凯氏试管中放入浓硫酸置于凯氏试管中放入消化炉加热至淡绿色（消化炉加热至淡绿色（1h左右）左右）冷却后加水移入冷却后加水移入100ml容量瓶中定容得空白容量瓶中定容得空白消化液。消化液。v2. 蒸馏与吸收：吸取蒸馏与吸收：吸取10ml 2%的硼酸于三角瓶中的硼酸于三角瓶中加加4d甲基红甲基红-溴甲酚绿混合指溴甲酚绿混合指示剂（若变绿色则用

34、示剂（若变绿色则用0.01mol/L HCl调至紫红色）。将其置于冷凝管下端并使管调至紫红色）。将其置于冷凝管下端并使管尖插入液面以下，再吸取尖插入液面以下，再吸取5ml消化液从漏斗上方加入蒸馏室内用水洗两次，并消化液从漏斗上方加入蒸馏室内用水洗两次，并加入加入10ml 40%NaOH后水封（注意：勿使漏斗内玻杆取下以防漏气），然后打后水封（注意：勿使漏斗内玻杆取下以防漏气），然后打开通气阀进行加热蒸馏，直至吸收液由紫红色变成绿色，计时蒸馏开通气阀进行加热蒸馏，直至吸收液由紫红色变成绿色，计时蒸馏3min先移先移去吸收液再停止加热以防倒吸。去吸收液再停止加热以防倒吸。v3. 滴定：用滴定：用0

35、.01mol/L HCl 滴定吸收液由绿色退去变红色为止，记下耗去标准滴定吸收液由绿色退去变红色为止，记下耗去标准盐酸的体积盐酸的体积V1.V0。v C：标准盐酸溶液摩尔浓度：标准盐酸溶液摩尔浓度(0.01)。vV1：滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。：滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。vV0：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。vW：样品重量（：样品重量（mg）。）。v14.01：氮的原子量。：氮的原子量。vK=5.7vM=12.5%vV2=100mlvV3=5ml五、结果计算五、结果计算100)1(01.14)(%3201KVVMWVVc）蛋白

36、质含量（实验六实验六 甲醛滴定测氨基氮甲醛滴定测氨基氮 一、实验目的一、实验目的v1加深对氨基酸两性解离的认识。加深对氨基酸两性解离的认识。v2掌握甲醛滴定法的原理及应用。掌握甲醛滴定法的原理及应用。三、实验仪器、试剂及材料三、实验仪器、试剂及材料1. 实验仪器：实验仪器： v 微量碱式滴定管（微量碱式滴定管（10ml）、）、2. 试剂：试剂： v (1)0.5酚酞指示剂：。酚酞指示剂：。v (2)1甘氨酸甘氨酸即即1克加克加100ml水配制而成水配制而成v (3)0.1molL标准氢氧化钠溶液（使用前需标定）。标准氢氧化钠溶液（使用前需标定）。v (4)中性甲醛溶液：取分析纯甲醛中性甲醛溶液

37、：取分析纯甲醛(3637)溶液溶液20ml，加，加0.5酚酞指示剂约酚酞指示剂约3滴滴，滴加，滴加0.100molL的氢的氢氧化钠溶液，使溶液呈微粉红色（临用前中和）。氧化钠溶液，使溶液呈微粉红色（临用前中和）。v氨基酸为两性离子，在水溶液中有下列平衡：氨基酸为两性离子，在水溶液中有下列平衡：v RCHCOO- +2HCHO RCHCOO- + H+v v NH3+ N(CH2OH)2v v常温下甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合生成亚羟甲基化合物，常温下甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合生成亚羟甲基化合物，使上述平衡右移促使使上述平衡右移促使NH3+释放释放H+，从而使溶液酸度增加，从而使溶液酸度增加，

38、滴定终点移至酚酞的变色域内（滴定终点移至酚酞的变色域内（pH值值9.0左右），左右），根据滴定根据滴定终点时所消耗标准碱的量即可算出反应体系中存在的游离氨终点时所消耗标准碱的量即可算出反应体系中存在的游离氨基即氨基氮的含量如果样品为一种已知的氨基酸，即可算出基即氨基氮的含量如果样品为一种已知的氨基酸，即可算出该氨基酸的含量。如果样品为未知氨基酸或几种氨基酸的混该氨基酸的含量。如果样品为未知氨基酸或几种氨基酸的混合物，则只能算出其氨基氮的含量。合物，则只能算出其氨基氮的含量。 二、实验原理二、实验原理四、操作方法四、操作方法v 已知氨基酸溶液中氨基酸含量的测定已知氨基酸溶液中氨基酸含量的测定:v

39、 取取3只三角瓶编号只三角瓶编号2ml 1% 甘氨酸甘氨酸2ml 1% 甘氨甘氨酸酸2ml 水（空白）水（空白）v均加均加5ml 水和水和5ml中性甲醛（用前加中性甲醛（用前加2滴滴 0.5% 酚酞酚酞滴加滴加0.1mol/LNaOH调至淡红色），及调至淡红色），及4滴滴 0.5%酚酚酞混匀酞混匀用用0.1mol/L滴至粉红色出现为止滴至粉红色出现为止分别记分别记下耗去标准碱的体积下耗去标准碱的体积(V1.V2.V0） 五、结果处理与计算五、结果处理与计算式中：式中：V：滴定样品所消耗标准碱的：滴定样品所消耗标准碱的平均平均体积（体积（ml）。）。 V0：滴定空白所消耗标准碱的体积（：滴定空白

40、所消耗标准碱的体积（ml）。）。 C：滴定时用标准氢氧化钠的浓度（：滴定时用标准氢氧化钠的浓度（0.1molL）. 14.01：lml lmolL氢氧化钠相当于氮的质量氢氧化钠相当于氮的质量（mg）。）。 100100/31/)2(/1100021475201.14)0(）（）甘氨酸含量（）（）甘氨酸含量（）氨基氮含量（mlgmlmgmlmgCVVv说明：说明：v 1.本法优点是简单快速，缺点是不够准确，其准本法优点是简单快速，缺点是不够准确，其准确度仅达到氨基酸或氨基氮理论含量的确度仅达到氨基酸或氨基氮理论含量的90。而。而且，如果样品液中含有脯氨酸或酪氨酸时滴定误且，如果样品液中含有脯氨酸

41、或酪氨酸时滴定误差更大，因为脯氨酸与甲醛作用后生成不稳定化差更大，因为脯氨酸与甲醛作用后生成不稳定化合物使结果偏低，酪氨酸的酚基结构又使结果偏合物使结果偏低，酪氨酸的酚基结构又使结果偏高。高。v 2甲醛滴定法常用以测定蛋白质的水解程度。甲醛滴定法常用以测定蛋白质的水解程度。v 3中性甲醛需临用前配制。放置一段时间后，中性甲醛需临用前配制。放置一段时间后，在使用前需重新中和。在使用前需重新中和。六、思考题六、思考题 为什么说甲醛滴定法可以测定蛋白质的水为什么说甲醛滴定法可以测定蛋白质的水解程度？除此之外还有哪些方法可以用来测解程度？除此之外还有哪些方法可以用来测定蛋白质的水解程度？定蛋白质的水解

42、程度？ 实验七酵母实验七酵母RNA的提取、组分鉴定和含的提取、组分鉴定和含量测定量测定一、实验目的一、实验目的v（1）了解并掌握稀碱法提取酵母）了解并掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。的原理和方法。v（2）了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。）了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。v（3）掌握地衣酚显色法测定酵母）掌握地衣酚显色法测定酵母RNA含量的原理和方法含量的原理和方法二、实验原理二、实验原理v酵母含酵母含RNA达达2.6710.0%，以酵母为原料使用稀碱使酵，以酵母为原料使用稀碱使酵母裂解，然后用酸中和母裂解，然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀醇

43、沉淀RNA。由此得到的。由此得到的RNA为变性的为变性的RNA，可用作制备，可用作制备核苷酸的原料。核苷酸的原料。 用硫酸水解用硫酸水解RNA后后,可生成磷酸、戊糖和碱基可生成磷酸、戊糖和碱基,各成分用以各成分用以下反应加以鉴定：下反应加以鉴定：（1）磷酸与钼酸铵试剂作用可生成黄色磷钼酸铵沉淀。）磷酸与钼酸铵试剂作用可生成黄色磷钼酸铵沉淀。（2）核糖与地衣酚试剂作用呈鲜绿色。）核糖与地衣酚试剂作用呈鲜绿色。（3）嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀。）嘌呤碱与硝酸银反应可生成白色的嘌呤银化物沉淀。vRNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核

44、糖继而转变成糠醛，后者与成糠醛，后者与3， 5-二羟甲苯（地衣酚或苔黑酚）反应二羟甲苯（地衣酚或苔黑酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，反应产物在产物在670nm处有最大吸收。处有最大吸收。RNA在在20250微克范围内，微克范围内，光吸收与光吸收与RNA浓度浓度 成正比。成正比。三、仪器和试剂三、仪器和试剂v1. 主要试剂主要试剂v（1）酵母粉）酵母粉 v（2）0.04M NaOH溶液溶液v（3）1.5M硫酸硫酸v（4）无水乙醚）无水乙醚v（5）95乙醇乙醇v（6）浓氨水）浓氨水v（7）酸性乙醇溶液）酸性乙醇溶液v （8）浓

45、硝酸）浓硝酸v（9）0.1M AgNO3 v（10）三氯化铁）三氯化铁-盐酸溶液。盐酸溶液。v（11）钼酸铵试剂）钼酸铵试剂v（12）50ugRNA标准溶液标准溶液v（13）苔黑酚）苔黑酚(3,5-二羟基甲苯二羟基甲苯)乙醇溶液乙醇溶液v（14）地衣酚）地衣酚-铜离子试剂铜离子试剂v（15）0.001M NaOH溶液溶液v2、器材：（、器材：（1）离心机）离心机v（2）分光光度计）分光光度计v（3）抽滤装置。）抽滤装置。 v（4）电子天平电子天平四、实验步骤四、实验步骤v1、酵母、酵母RNA提取提取v称称5g干酵母粉于干酵母粉于20mL 0.04M NaOH溶液中并在溶液中并在研钵研钵中研成中

46、研成浆状并转入三角烧瓶中。再用浆状并转入三角烧瓶中。再用10mL 0.04M NaOH溶液洗涤溶液洗涤并转入三角烧瓶中，沸水浴加热并转入三角烧瓶中，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。，冷却，转入离心管。3000转转/分，离心分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入分钟后，将上清慢慢倾入 10mL酸性乙酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，沉淀完全后，3000r/min离心离心3min。弃去上清液。用。弃去上清液。用95乙醇乙醇10 mL洗涤洗涤沉淀。再用乙醚沉淀。再用乙醚10 mL洗涤沉淀并将沉淀转移至布氏漏斗抽洗涤沉淀并将沉淀转移至布氏漏斗抽滤（

47、先称量滤纸重滤（先称量滤纸重W1），沉淀在空气中干燥），沉淀在空气中干燥30min。称量。称量所得所得RNA粗品和滤纸重粗品和滤纸重W2。W2- W1即为即为RNA粗品重量粗品重量v2、酵母、酵母RNA水解水解v取取100 mg粗提的酵母粗提的酵母RNA于三角瓶中，加入于三角瓶中，加入1.5M硫酸硫酸10mL, 沸水浴加热沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。v3、RNA组份鉴定组份鉴定v（1）嘌呤碱：）嘌呤碱：v取水解液取水解液1mL于试管中滴加入于试管中滴加入40滴浓氨水。然后加入滴浓氨水。然后加入20滴滴0.1M硝酸银溶液，观察有无白色嘌呤碱银

48、化合物沉淀。硝酸银溶液，观察有无白色嘌呤碱银化合物沉淀。v（2）核糖：）核糖：v取水解液取水解液1mL于试管中加入三氯化铁浓盐酸溶液于试管中加入三氯化铁浓盐酸溶液40滴和苔黑滴和苔黑酚乙醇溶液酚乙醇溶液4滴。放沸水浴中滴。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变。注意观察核糖是否变成绿色。成绿色。v（3）磷酸：）磷酸：v取水解液取水解液1mL于试管中加于试管中加5滴浓硝酸酸化，再加入滴浓硝酸酸化，再加入20滴钼酸滴钼酸铵溶液在沸水浴上加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生。铵溶液在沸水浴上加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生。v4. RNA含量测定含量测定v（1）标准曲线的制作：（每）标准曲线的制作

49、：（每4组组8人做人做1标准曲线）标准曲线）v以以RNA微克数为横坐标，以微克数为横坐标，以A670为纵坐标绘制标准曲线为纵坐标绘制标准曲线。v（2）样品的处理：）样品的处理：v称取称取10mg粗提的酵母粗提的酵母RNA加入加入100 mL0.001M NaOH溶液溶液混匀即得样品液混匀即得样品液.v（3）酵母）酵母RNA含量测定：含量测定：v取试管取试管1支加入支加入2 mL样品液，再加样品液，再加2 mL地衣酚地衣酚-铜试剂沸水铜试剂沸水加热加热25分钟冷却后测定分钟冷却后测定A(用用1号调零号调零) v四、结果处理四、结果处理v1. 酵母酵母RNA得率（得率（%）=（W2-W1）*100

50、Wv 其中其中 W-干酵母粉重量（克）干酵母粉重量（克）v2. 粗提的酵母粗提的酵母RNA含量（含量（%）=m*V1*100V2*W/v其中其中 W/-酵母酵母RNA重量（重量（mg）v m-从标准曲线上查得从标准曲线上查得RNA的微克数的微克数v V1-100 mLv V2-2 mL实验八赖氨酸含量测定实验八赖氨酸含量测定一、实验目的一、实验目的掌握谷物中赖氨酸含量的测定方法及原理。掌握谷物中赖氨酸含量的测定方法及原理。二、实验原理二、实验原理v蛋白质中赖氨酸的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及蛋白质中赖氨酸的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为

51、此培育高含量赖氨酸的人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法，测定显色法和染料结合法，测定小麦小麦种子中赖氨酸含量。种子中赖氨酸含量。v谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的NH3与茚三酮试剂可发生颜与茚三酮试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色深浅与赖氨酸残基的数目成正色反应，生成紫红色物质，其颜色深浅与赖氨酸残基的数目成正相关，而其它氨基酸没有自由氨基，不能发生这一反应。选用碳相关，而其它氨基酸没有自由氨基，不能发生这一反应

52、。选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。三、实验仪器、试剂三、实验仪器、试剂 1主要主要仪器：仪器：v（1）分光光度计分光光度计v（2）离心机）离心机v（3）电子天平）电子天平2试剂：试剂：v（1）茚三酮试剂）茚三酮试剂v（2）2碳酸钠溶液碳酸钠溶液v（3）4碳酸钠溶液碳酸钠溶液v（4）0.1mol/L亮氨酸溶液亮氨酸溶液v（5）95%乙醇乙醇四、实验步骤四、实验步骤v1.标准曲线的制作（每2组4人做1标准曲线） 以亮氨酸的微克数为横坐标，以以

53、亮氨酸的微克数为横坐标，以A515纵坐标绘制标准曲线纵坐标绘制标准曲线v 2、样品的处理与测定：在电子天平上称取小麦、样品的处理与测定：在电子天平上称取小麦粉粉10mg于具塞试管底部于具塞试管底部加加1ml 2% 碳酸钠于碳酸钠于80水浴中保温提取水浴中保温提取10min加加2ml茚三铜试剂茚三铜试剂80水水浴中保温浴中保温30min后冷却至室温后冷却至室温加加5ml 95%乙醇和乙醇和5ml蒸馏水充分混匀后转移至离心管中蒸馏水充分混匀后转移至离心管中3000转转/分分 离心离心3min（离心前必须平衡）（离心前必须平衡）取上清液测取上清液测A515（用（用1#管调零管调零)五、结果计算五、结

54、果计算v赖氨酸含量（赖氨酸含量（%）v式中：式中：m：标准曲线上查出的亮氨酸的量；：标准曲线上查出的亮氨酸的量； v1.11=Mlys/MleuvW：为样品的干重（：为样品的干重（mg）。）。vB=0.05B100W1011.1m3实验九、凝胶层析法分离蛋白质实验九、凝胶层析法分离蛋白质一、实验目的一、实验目的v学习凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理，了解凝胶层析法的学习凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理，了解凝胶层析法的操作方法。操作方法。二、实验原理二、实验原理 凝胶层析又称分子筛层析，是利用有一定孔径凝胶层析又称分子筛层析，是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进范围的多

55、孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。把含有不同大小分子的混合液，行分离的层析技术。把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。由于凝胶具有网铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部而受阻滞部而受阻滞,流速缓慢流速缓慢,流程长而后被洗脱；而比网流程长而后被洗脱；而比网孔大的分子则不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的孔大的分子则不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙先被洗脱空隙先被洗脱(阻力小

56、阻力小,流程短流程短,流速大流速大)。因此，在洗。因此，在洗脱小分子物质后流出（洗脱体积大），从而达到分脱小分子物质后流出（洗脱体积大），从而达到分离的目的。离的目的。三、实验仪器、试剂三、实验仪器、试剂1.主要仪器：主要仪器：（1）凝胶凝胶层析仪层析仪（2）电子天平）电子天平（3）层析柱）层析柱2.试剂：试剂：（1）Sephadex G100（2）牛血清白蛋白）牛血清白蛋白（3）细胞色素）细胞色素C（4）血红蛋白）血红蛋白（5）核糖核酸酶）核糖核酸酶v 四、操作步骤四、操作步骤v 1、凝胶的选择与处理：称取凝胶干粉加过量水浸泡过夜，弃去上层细、凝胶的选择与处理：称取凝胶干粉加过量水浸泡过夜，

57、弃去上层细 小颗粒混匀后装柱小颗粒混匀后装柱v2. 装柱：将柱子垂直固定在铁架上，先向主内加入四分之一柱长水，装柱：将柱子垂直固定在铁架上，先向主内加入四分之一柱长水，再将凝胶倒入柱内，打开下端开口，继续灌入凝胶，直至床面距上端再将凝胶倒入柱内，打开下端开口，继续灌入凝胶，直至床面距上端5cm左右，观察柱内凝胶是否均匀，有无气泡及断层出现。左右，观察柱内凝胶是否均匀，有无气泡及断层出现。v3. 平衡：柱子装好后放置平衡：柱子装好后放置20min，用洗脱液平衡柱子直至床面不再下，用洗脱液平衡柱子直至床面不再下降为止，用蓝色葡聚糖降为止，用蓝色葡聚糖2000检测柱子是否均匀。检测柱子是否均匀。v4

58、. 上样与洗脱：加样前检查床面是否平整，若不平衡用玻璃棒搅拌凝上样与洗脱：加样前检查床面是否平整，若不平衡用玻璃棒搅拌凝胶使其自然下沉，在胶面上放置圆形滤纸片防止加样时冲击床面，用胶使其自然下沉，在胶面上放置圆形滤纸片防止加样时冲击床面，用胶头滴管吸去上层多余水，然后慢慢滴加胶头滴管吸去上层多余水，然后慢慢滴加10d牛血清蛋白样品（每组牛血清蛋白样品（每组8人加人加1次样，两次加样间隔次样，两次加样间隔20min），待样品进入凝胶后，向床面滴加），待样品进入凝胶后，向床面滴加2cm高度水防止干胶，拧紧螺丝；打开恒流泵，紫外检测仪，记录仪高度水防止干胶，拧紧螺丝；打开恒流泵，紫外检测仪，记录仪及

59、部分收集记下初始笔尖位置，直至峰值出现记录笔移动距离及部分收集记下初始笔尖位置，直至峰值出现记录笔移动距离L。v5、仪器参数设置及调整：紫外检测仪：当档位置于、仪器参数设置及调整：紫外检测仪：当档位置于100%T时，调光时，调光量至数显为量至数显为100。当档位置于。当档位置于0.5A时时 调调A数显为数显为0 记录仪：设置纸速记录仪：设置纸速2cm/h 部分收集器：设置每部分收集器：设置每10min收集收集1管，调恒流泵流速使每管收管，调恒流泵流速使每管收集液体为集液体为4ml 即即v=0.4ml/min五、结果计算五、结果计算v1、以管号（或洗脱液体积）为横坐标、相应管的、以管号（或洗脱液

60、体积）为横坐标、相应管的A280为纵为纵坐标，绘制洗脱曲线。坐标，绘制洗脱曲线。v 2、根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积、根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积Ve，然后，然后以蛋白质分子量的对数值（以蛋白质分子量的对数值（logMr）为横坐标、）为横坐标、Ve为纵坐标，为纵坐标，作出分子量标准曲线。作出分子量标准曲线。v 3、样品完全按照标准曲线的条件操作，根据紫外检测获、样品完全按照标准曲线的条件操作，根据紫外检测获得的洗脱体积，从分子量标准曲线查出相应的分子量。得的洗脱体积，从分子量标准曲线查出相应的分子量。v注意事项：注意事项：v1.层析柱上方要留有少量液体，避免使凝胶暴露于空气