G_四链体DNA_抗肿瘤药物的潜在靶点

1、G2四链体DNA:抗肿瘤药物的潜在靶点65综述与专论XG2四链体DNA:抗肿瘤药物的潜在靶点陆 涛, 韩海泳, 倪沛洲, LaurenceH.Hurley22(1.中国药科大学有机化学教研室,江苏南京210009;2.ArizonaCancerCenter,Tucson,AZ85724,USA)摘 要:除了常见的双链DNA,某些富含G碱基的DNA序列通过四个鸟嘌呤环的互联作用可折叠成四链螺旋结构,这样的DNA二级结构被称为G2四链体。本文综述了G2四链体可能的生物学作用以及作为抗肿瘤药物潜在靶点能与其相互作用的化合物的研究与开发。关键词:G2四链体;DNA二级结构;抗肿瘤药物;端粒;端粒酶抑制

2、剂中图分类号:Q523+.4;R979.1 文献标识码:A 文章编号:100125094(2001)0220065206G2quadruplexDNA:APotentialTargetforAnti2cancerDrugDesignLUTao1, HANHai2yong2, NIPei2zhou1, LaurenceH.Hurley2(1.DivisionofOrganicChemistry,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China; 2.ArizonaCancerCenter,Tucson,AZ85724,USA)Abstract:I

3、nadditiontothefamiliarduplexDNA,certainG2richDNAsequencescanbefoldedintofour2strandedstructures,whicharemadeupoffourguanine(G)bases,andthesecondarystructuresarecalledG2quadruplexes.Inthisreview,thepossiblebiologicalrolesofG2quadruplexesandthedevelopmentofG2quadruplex2interactivecompoundsasanti2cance

4、rdrugswerehighlighted.Keywords:G2quadruplex;DNAsecondarystructure;Anti2cancerdrug;Telomere;Telomeraseinhibitor 最常见的DNA是由两条互补链通过碱基配对的方式所形成的双链螺旋结构。然而,某些含有大量鸟嘌呤碱基重复序列的DNA可以形成四链螺旋结构,因此被称为G2四链螺旋(或G2四链体)。人们发现在染色体端粒末端以及一些重要的肿瘤基因转录调节区,具有这种特殊的结构序列。因为肿瘤基因表达的端粒维持机制和转录调节已成为肿瘤药物设计的重要靶点,所以G2四链体结构有可能成为抗肿瘤药物的新靶点。G2

5、四链体DNA由堆积的G2四分体组成,而每个四分体则由4个鸟嘌呤以环状氢键作用平面互联构成(见图1a)。一价阳离子如K+或Na+能稳定G2四链体,推测其可能是通过与四分体中8个羰基氧原子的相互作用所致1。现已发现,体外存在着几种G2四链体结构,根据它们的分子特性及螺旋取:向,G2四链体可分为如下几类:¹含有鸟嘌呤重复序列的4个TTAGGG单链所形成的分子间四链体即平行型(parallel)四链体,见图1b2;º含有两个或多个鸟嘌呤重复序列(TTAGGG)n,n>2的DNA可形成G2G发夹型(hairpin),接着双分子化构成几种稳定的双分子四链体结构(图1c);

6、7;具有4个或更长的鸟嘌呤重复序列(TTAGGG)n,n2可以自身折叠形成分子内的四链体结构即自身折叠型(fold2over)四链体,见图1d。过去10年中,随着端粒/端粒酶分子生物学及DNA合成和生物物理学的迅速发展,提高了人们对G2四链体的分子结构和动力学的了解。尽管G2四链体在体内的存在尚有待于证实,但一些间接的证据表明这种结构可能在细胞内起非常重要的作用。因其独特的结构特点和可能的细胞内作用,G2四链4366药 学 进 展 2001年 第25卷 第2期体已成为一个非常有吸引力的药物设计靶点5。本文着重介绍G2四链体的生物学作用及与G2四链体相互作用的化合物设计和开发。图1 G2四分体和

7、G2四链体a.4个G碱基形成的平面结构)G2四分体;b.4条G丰富DNA单链形成分子间G2四链体;c.双分子型G2四链体;d.分子内型G2四链体1 G2四链体可能的生物学作用尽管含有G重复序列的DNA在体外Na+或K+的生理浓度下,可以很容易形成G2四链体结构,但在体内G2四链体的形成可能要复杂得多。这首先是因为,大多数含重复G碱基的基因组在细胞周期中通过碱基配对形成稳定的双链螺旋结构;其次,在体内DNA通常与特异或非特一性蛋白质结合在一起;再者,体外分子间G2四链体的形成需要较高的DNA浓度,这在体内不可能实现,况且在体内G2四链体的形成可能不需要如此高的DNA浓度。近来发现4种DNA解旋酶

8、能解旋G2四链体结构69,其中Sgs1解旋酶最为引人注意,因为其解四链体能力比解双链螺旋强10倍8,这提示细胞内可能存在消除G2四链体结构的机制。更重要的是,G2四链体可能为一正常结构,其在细胞内可自行聚集和解聚。由于在复制、重组、转录和端粒DNA延长过程中,双链DNA在细胞内会短暂地分离为单链,因此为富含G的DNA链形成G2四链体提供了机会。1.1 端粒的保护和延长端粒是真核细胞中线性染色体的特殊末端。由呈串联排列的双链重复亚单位DNA片断和一段单链富含G重复亚单位(TTAGGG)的突出及端粒结合蛋白所构成10,11。为避免端粒的降解、端端融合、重排和丢失而引起基因不稳定和细胞衰老,维持单链

9、突出的完整性是细胞存活所必须的,而G2四链体c的形成提供了保护32末端突出的可能的分子机制。一种模型认为,富含G的单链重复亚单位(TTAGGG)可自身折回,通过G2G碱基对,形成发夹,结合形成G2四链体,故称hairpin2hairpinG2四链体。另一模型建议,32末端突出通过几次折叠形成分子内的自身折叠型G2四链体,这种结构很可能出现在DNA复制阶段中一段较长的单链重复末端短暂存在时13。G2四链体与由端粒酶引起的端粒延长也有一定的关系。端粒酶为可使端粒延伸的反转录DNA合成酶,是由RNA和蛋白质组成的核糖核酸蛋白质酶,其中蛋白质组分具有催化活性,且以RNA组分的4351序列为模板,以端粒

10、32末端为引物,合成端粒重复序列。令人感兴趣的是端粒酶仅用9个碱基片段的RNA为模板可增加数以百计的端粒重复序列。一种可能的模型是端粒酶的延长作用涉及一易位步骤,在此步骤中,延长了的端粒DNA被从RNA上置换出来15。其可能的机制是,端粒DNA短暂地形成自身折叠型G2四链体结构,从而提供牵引力以置换及帮助DNA底物和RNA模板所形成的碱基对向后移动一个重复序列;其后,在端粒DNA和RNA重新配对进行下一个延长循环前,G2四链体又解聚为一单链。人们发现G2四链体结构的稳定剂(如K+和BSU1051)在每延长4个重复序列后可引起周期性停顿,而抑制端粒酶的活性15,该实验结果支持了上述端粒延长的模型

11、设想。因此,由端粒DNA所形成的G2四链体成为开发端粒酶抑制剂的新靶点。1.2 转录调节某些重要基因的启动区,例如人或鸡B2珠蛋白基因、兔前胰岛素原II基因、腺病毒血清型2、视网膜神经蚀质瘤敏感性基因和c2Myc基因中,皆发现有富含G的重复序列,因此它们都具有形成G2四链16c14,1512c,G2四链体DNA:抗肿瘤药物的潜在靶点67他一些肿瘤基因启动区也具有富含G的重复序列。这些发现促使研究人员推测G2四链体在基因转录调节过程中起一定作用。另外,G2四链体能阻断RNA聚合酶17。因此当基因密码区的富含G重复序列形成G2四链体,而又不易解聚时,可能会起到抑制RNA聚合酶的作用,从而引起早期转

12、录的停止。1.3 其他功能除了端粒保护和转录调节外,G2四链体可能还与染色体的排列重组和与DNA复制相关的疾病有一定的关系。富含G重复序列形成G2四链体,不仅提供了重组过程中染色体排列的机制,同时也会促使DNA发生异常重组。最近,两类重组因子)人BLM解旋酶和酵母Sgs1解旋酶已被证实具有解旋G2四链体的作用7,8。在缺乏这些解旋酶的细胞中,显示同源染色体之间相互交换水平的升高和染色体的不稳定。这些发现说明细胞内的解旋酶可能被用来分解不需要的G2四链体,以防止异常重组和其它基因的不稳定性。2 以G2四链体为靶点的小分子化合物自从1991年Zahler等证实对K+离子稳定的G2四链体能抑制端粒酶

13、的活性,G2四链体DNA已成为寻找端粒酶抑制剂的新靶点5。在G2四链体结构的基础上,若干研究小组成功地设计和合成了与其相互作用的先导化合物,到目前已开发出几类化合物,且广泛研究了它们与G2四链体的相互作用19,20。2.1 二酰胺蒽醌类化合物蒽醌类衍生物起初被开发作为与DNA相互作用的化合物,具有较广的抗肿瘤谱。2,62二酰胺蒽醌类化合物显示出选择性地作用于三链DNA,而对双链DNA亲和力较小。分子模型研究预测该类化合物可以以线性嵌入的方式与四链体结合22,Sun等首次通过1HNMR研究了2,62二酰胺蒽醌衍生物BSU1051的结合模型,发现其可结合并稳定G2四链体结构。应用非Taq聚合酶人端

14、粒酶分析也证实该化合物是通过与分子内G2四链体相互作用而抑制端粒酶活性15。最近,大量蒽醌类化合物被合成并测定其对端粒酶的抑制活性,其中Perry等20先后合成了近100个1,42、1,52、1,82、2,62和2,72二酰胺蒽醌的位置异构体,采用非细胞端粒酶分析法,测得其主要化合物的端粒酶抑制活性,其中一些化合物范围,2118较强的小分子端粒酶抑制剂。2.2 阳离子型卟啉类化合物很长一段时间以来,卟啉类化合物在肿瘤的荧光疗法方面备受关注,这主要是因为与正常组织相比较,它们可在肿瘤组织中蓄积达较高浓度,研究人员推测卟啉的芳香环平面结构,使得该类化合物可通过与G2四分体堆积型的相互作用而结合到G

15、2四链体结构上。根据圆二色散和NMR数据,Hurley和Sheardy研究小组分别发现卟啉衍生物TMPyP4四2(N2甲基242吡啶基)卟啉可以结合并稳定G2四链体结构23,24,并且通过这种作用抑制端粒酶活性。而其22位异构体TMPyP2四2(N2甲基222吡啶基)卟啉24,25则无活性。光裂解分析显示,由于这两个异构体与G2四链体结合部位的不同而导致它们与G2四链体相互作用上的差异。根据理论推测,由于22位异构体存在较大的空间位阻,使得整个结构在与G2四链体相互作用时难以形成平面而嵌入其中,需要较高的能量。到目前为止,研究人员提出了两种不同的G2四链体结合模型,根据光裂解分析推测其中一种可

16、能的模型为卟啉分子分别堆积到处于G2四链体结构25末端的G2四分体的上下两边;另一种模型是基于分子模型和化学计量法提出,即卟啉分子是嵌入两个G2四分子体之间26。尽管分子模型研究和光谱数据皆支持这两种观点,但光裂解数据为外在堆积式模型提供了更好的实验证据。应用肿瘤细胞株研究表明,TMPyP4比TMPyP2更具较强的抑制细胞生长作用,该结果与端粒抑制活性相一致27;另外TMPyP4可诱发后期染色体桥,而TMPyP2无此作用。该结果表明与G2四链体相互作用的化合物在细胞内可能直接作用于端粒。Yayon研究小组已证实29,TMPyP4的对甲苯磺酸盐(TMPP)对成纤维细胞生长因子(FGF2)和血管内

17、皮细胞生长因子(VEGF)的受体结合与激活具有很强的抑制活性,从而抑制内皮细胞增长、肿瘤增生和转移。在合成了大量卟啉衍生物的基础上,通过合理改变卟啉环上的特殊基团,可以改进先导化合物TMPP对FGF和VEGF的抑制活性。其中P1016为一具有3个正电荷的非对称卟啉衍生物;P1020则具有4个正电荷,但电荷间距离较远。二者皆明显具有较TMPP强的活性;更有意义的是,同时发现一类新骨架(Corrole)衍生物P1021,其生物活性最强。2868药 学 进 展 2001年 第25卷 第2期DNA合成阻滞法15,17筛选了150多个卟啉类似物,其中一些显示非常高的与G2四链体相互作用活性,在此基础上的

18、构效关系研究表明,¹整个分子可形成平面型结构,以利于分子插入G2四链体结构中;º卟啉环四周具有正电荷取代基是必须的,且电荷数目影响其相互作用的活性:4+>3+>2+;»氢键的引入以及边链的长度影响其活性;¼某些不对称基团的引入可增强与反平行(antiparallel)或自身折叠型G2四链体的相互作用。2.3 Perylenes类化合物通过应用计算机辅助药物设计软件DOCK,认为Perylenes是一类与G2四链体相互作用较强的化合物。在该分子模型的基础上,Fedoroff等30设计并合成了N,N2双22(12哌啶基)乙基23,4,9,102北

19、四甲酰二亚胺(PIPER),此分子两侧末端分别含有一阳离子电荷。现已通过实验证实PIPER是一强特异性与G2四链体作用的化合物,而与单链或双链DNA作用微弱。PIPER2G2四链体复合物的NMR结构分析显示其G2四链体的结合模型与卟啉类化合物相似(即外向堆积在G2四分体上)。同其他与G2四链体相互作用的化合物相似,PIPER具有良好的端粒酶和DNA聚合酶抑制活性。然而更有意义的是,该化合物具有促进G2四链体形成的作用31。这一发现说明除了被动的结合和稳定G2四链体结构外,这类化合物还可能在细胞内起诱导G2四链体形成的作用。c图2 能与G2四链体相互作用的化合物G2四链体DNA:抗肿瘤药物的潜在

20、靶点692.4 其它化合物除了以上三类化合物,人们还发现某些与DNA双链螺旋相互作用的化合物,也具有与四链体作用的活性,例如溴乙啡啶(EthidiumBromide,EtBr),原为一强效双链螺旋嵌入剂,据报道其可嵌入G2四分体之间并稳定G2四链体结构32。Harrison等33合成了一系列3,62二取代吖啶类衍生物,其结构与蒽醌类化合物相类似,母核皆为三元环平面刚体结构,生物学实验显示其通过稳定端粒DNA所形成的G2G四链体而抑制端粒酶活性,IC50值在1.38.0Lmol/L范围。Chen等345MergnyJL,HeleneC.G2quadruplexDNA:atargetfordrug

21、designJ.NatMed,1998,4:136621367.6BaranN,PucshanskyL,MarcoY,etal.TheSV40largeT2antigenhelicasecanunwindfour2strandedDNAstructureslinkedbyG2quartetsJ.NucleicAcidsRes,1997,25:2972303.7SunH,KarowJK,HicksonID,etal.TheBloomcssyndromehelicaseunwindsG4DNAJ.JBiolChem,1998,273:27587227592.8SunH,BennettRJ,Maiz

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23、ousecellsJ.NucleicAcidsRes,1999,27:396423969.11ZakianVA.Telomeres:beginningtounderstandtheendJ.Science,1995,270:160121607.12SundquistWI,KlugA.TelomericDNAdimerizesbyforma2tionofguaninetetradsbetweenhairpinloopsJ.Nature,1989,342:8252829.13WellingerRJ,WolfAJ,ZakianVA.Saccharomycestelom2eresacquiresing

24、le2strandTG123tailslateinSphaseJ.Cell,1993,72:51260.14SalazarM,ThompsonBD,KerwinSM.etal.Thermallyin2ducedDNA2RNAhybridtoG2quadruplextransitions:possibleimplicationsfortelomeresynthesisbytelomeraseJ.Bio2chemistry,1996,35:16110216115.15SunD,ThompsonB,CathersBE,etal.InhibitionofhumantelomerasebyaG2quad

25、ruplex2interactivecompoundJ.JMedChem,1997,40:211322116.16SimonssonT,PecinkaP,KubistaM.DNAtetraplexforma2tioninthecontrolregionofc2MycJ.NucleicAcidsRes,1998,26:116721172.17HanH,HurleyLH,SalazarM.DNApolymerasestopassayforG2quadruplex2interactivecompoundsJ.NucleicAcidsRes,1999,27:5372542.18FahlmanRP,Se

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27、无此特征。因此,有人认为该化合物可以作为发夹型G2四链体的特殊探针。3 结 语一系列研究表明,DNA二级结构G2四链体可能是药物设计的新的合适靶点。从目前所获得的G2四链体结构信息和生物学结果来看,所设计的药物最终仍可能是作用于G2四链体2蛋白质的复合物。尽管G2四链体的多形性似乎使人们感觉其结构非常复杂,但这并非意味着其没有规律及共同特点。如前所述,某一G2四链体的形成取决于特定的条件及分子伴娘或其他诱导化合物的存在。人们已证实某些蛋白质可加速G2四链体结构的形成,而另一些蛋白质(如解旋酶)可促使这种结构解旋。因此,研究G2四链体的形成与解旋的化学动力学及在此过程中与其相互作用的化合物所起作

28、用,乃是以G2四链体为新靶点的药物设计与开发的重要部分。参考文献:1SundquistWI,KlugA.TelomericDNAdimerizesbyformationofquaninetetradsbetweenhairpinloopsJ.Nature,1989,342:8252829.2WangY,PatelDJ.Solutionstructureofaparallel2strandedG2QuadruplexDNAJ.JMolBiol,1993,234:117121183.3KangC,ZhangX,RatliffR,etal.Crystalstructureoffour2strande

29、dOxytrichatelomericDNAJ.Nature,1992,356:1262131.4WangY,PatelDJ.SolutionstructureoftheOxytrichatelomer2icrepeatdG4(T4G4)3G2tetraplexJ.JMolBiol,1995,70药 学 进 展 2001年 第25卷 第2期cancerchemotherapyJ?ExpOpinTherPatents,1998,8:156721586.cationicporphyrinsasG2quadruplexinteractiveagentsinhu2mantumorcellsJ.Canc

30、erRes,1999,59:6392644.28IzbickaE,NishiokaD,MarcellV,etal.Telomere2interac2tiveagentsaffectproliferationratesandinducechromosomaldestabilizationinseaurchinembryosJ.AnticancerDrugDes,1999,14:3552365.29AviezerD,CottonS,DavidM,etal.Porphyrinanaloguesasnovelantagonistsoffibroblastgrowthfactorandvasculare

31、n2dothelialgrowthfactorreceptorbindingthatinhibitendothelialcellproliferation,tumorprogression,andmetastasisJ.CancerRes,2000,60:297322980.30FedoroffOY,SalazarM,HanH,etal.NMR2basedmodelofatelomerase2inhibitingcompoundboundtoG2quadruplexDNAJ.Biochemistry,1998,37:12367212374.31HanH,CliffCL,HurleyLH.Acc

32、eleratedassemblyofG2quadruplexstructuresbyasmallmoleculeJ.Biochemistry,1999,38:698126986.32GuoQ,LuM,MarkyLA,etal.Interactionofthedyeethid2iumbromidewithDNAcontainingguaninerepeatsJ.Bio2chemistry,1992,31:245122455.33HarrisonRJ,GowanSM,KellandLR,etal.Humantelom2eraseinhibitionbysubstitutedacridinederi

33、vativesJ.BioorgMedChem,1999,9:246322468.34ChenQ,KuntzID,ShaferRH.SpectroscopicrecognitionofguaninedimerichairpinquadruplexesbyacarbocyaninedyeJ.ProcNatlAcadSciUSA,1996,93,263522639.Biochemistry,1998,37:2709221HaqI,LadburyJE,ChowdhryBZ,etal.Molecularanchor2ingofduplexandtriplexDNAbydisubstitutedanthracene29,102dion