Alzheimer病患者海马神经元核仁组成的研究

1、    Alzheimer病患者海马神经元核仁组成的研究        摘要目的间接了解Alzheimer's病(AD)海马神经元总体基因表达水平。方法10例AD患者病理脑海马组织经Nissl's染色后，像分析神经元核仁、核浆比值，核仁组成区银染色后像分析神经元着色面积及积分吸光度，并与相应的正常青年组、老年组各10例的海马标本进行比较对照。结果老年组和AD组海马神经元核浆比值(分别为54.1±8.1及52.8±9.7)下降与青年组(60.

2、8±5.9)相比，差异有显著性(P<0.05及0.01)；老年组与AD组相比，差异无显著性(P>0.05)。同时，老年组和AD组海马神经元核仁着色面积减少，积分吸光度减弱；老年组和AD组相比，AD组海马神经元核仁着色面积(21.17±5.48um)及积分吸光度(173.24±42.81)相对增强，与老年组(分别为18.06±6.61um与141.43±54.99)相比，差异有显著性(均为P<0.05)。结论Nissl's染色说明老年人和AD患者海马神经元功能低下，核仁组成区银染色提示老年人和AD患者神经元rDNA转录活

3、性低下，但AD患者海马神经元转录活性相对增高，其细胞总体基因表达活性相对增强，此种细胞形态学上的变化可能代表了细胞的一种防御系统。关键词Alzheimer病核仁组成区基因 Investigation of the Nucleolar Organizer Regions in the Hippocampal Neurons of Alzheimer's DiseaseLu Wenfu, Tang Hongchuan, Fan Ming,et alDepartment of Neurology,The General Hospital of PLA (Beijing 100853)Abst

4、ractObjectiveTo determine indirectly the degree of total gene expression in the hippocampal neurons of Alzheimer's disease (AD).MethodsNeuropathological examination was carried out in 10 cases of AD and control groups,including the Yang and elderly patients without any neurological disorder.The

5、nucleoli-nucleoplasm ration,stained area and intergral optical density of silver-stained nucleolar orgnizer regions (NORS) in the hippocampal neurons studied by image analysis after Nissl's and silver-stainings.ResultsThe nucleoli-nucleoplasm rations of hippocampal neurons were decreased in both

6、 of AD and elderly groups,in comparision with young group,with significant difference statistically (P<0.05 and P<0.01 respectively).There was no significant difference between the AD and elderly group (P>0.05) The stained area and intergral optical density in hippocampal neurons were also

7、reduced in the AD and elderly groups as compared with young group.But the stained area and intergral optical density of hippocampal neurons were increased more significantly in the AD group than that in the elderly group (P<0.05).ConclusionsThe results of nucleoli-nucleoplasm rations indicated th

8、at the hippocampal neuron functions in the AD and elder were declined because of degenerative process of neurons.The results of silver-stained NoRs suggested that more active translating activity of rDNA in the AD hippocampal neurons might represent the cell defence function although the translating

9、 activity was diminished in the AD and elderly groups.Key wordsAlzheimer diseaseNucleolar organizer regionsGeneAlzheimer病(AD)是发生在中年或老年期的一种进行性和不可逆性神经性变性疾病，临床上以进行性痴呆为主要表现，常伴以精神行为异常而缺乏局灶定位体征，其确诊主要靠尸检。近年来，越来越多的资料提示，基因异常可能和AD发病有关。核仁组成区(nucleolar organizer regions;NORs)是染色体上含有核糖体核糖核酸(ribosome ribonucleic

10、acid;rRNA)基因的区段，通过银染色方法，NORs的染色体蛋白被不同程度的染色1。银染色的能力与核糖体基因转录状态有相应的关系2，3。为此，我们对AD患者海马神经元NORs进行研究，以了解核仁组成区的活性，即细胞总体基因表达的活跃程度。1对象和方法1.1模型与分组病理脑海马组织10例AD患者(男7例，女3例)严格按AD临床诊断标准进行筛选，生前无任何神经疾患，其临床诊断进一步由病理所证实，即相应的年龄组内在海马、颞叶、额叶皮层内出现大量的老年斑及神经元纤维缠结，并和相应的正常青年组、老年组海马标本各10例进行比较、对照分析(表1)。表1AD和青年、老年患者年龄比较分组例数±st

11、值P值青年组1030.8±7.8老年组1078.1±8.113.7<0.001*AD组1076.8±9.811.40.373<0.001*>0.05*青年组与老年组，*青年组与AD组，*老年组与AD组结果表明：老年和AD患者海马神经元功能状态低下或功能紊乱，可能反应了神经元的退变。1.2技术方法(1)HE染色。(2)银染色(Bodian)染色。(3)尼氏染色(甲苯胺蓝法)。(4)核仁银染：将厚10um的海马组织石蜡切片脱水、水化，将明胶溶于1%甲酸内配成2%溶液，将此溶液按12容积与5%硝酸银溶液混合制成银NORs染色工作液，将此工作液滴于切片下

12、，在20室温下避光反应30分钟以上，然后用去离子水冲洗、脱水、透明、封固。(5)像分析：将制备好的玻片置于Leits显微镜下，用高灵敏硒化镉摄像装置将组织景象投身到Quantime像分析仪(英国剑桥公司)的分析荧光屏上，以指令输入器选择指令并共同调节显微镜光照度及焦距，设定检测阈，保证灰度分离，经2D转换后进行测定，每张切片随机挑选812个神经元进行测量，至少测量来自每组分的3个不同组织块的切片。结果以机载Quips软件分析处理。测量平均值表示为±s，并对青年、老年和AD三个组的测量结果进行t检测分析。2结果2.1尼氏染色神经元核浆比值的变化脑海马组织切片经尼氏染色后，神经元呈淡蓝色

13、，细胞核呈深蓝色，分析核浆比值的变化可以了解细胞的功能状态(表2)。表2尼氏染色三组患者神经元核浆比值分组细胞数±st值P值青年组6060.8±5.9老年组6054.1±8.12.538<0.05*AD组6052.8±9.72.6371.976<0.01*>0.05*青年组与老年组，*青年组与AD组，*老年组与AD组2.2核仁银染、细胞总体基因的表达核仁组成区银染后，银与NORs的染色体蛋白结合后成为深棕色小颗粒位于细胞核内，细胞核心呈淡黄色，此方法可显示细胞内rDNA的转录活性，一般认为可反映细胞总体基因表达的活跃程度(表3，4)。表

14、3核仁银染三组患者神经元核仁着色面积(m2)分组细胞数±st值P值青年组9723.82±7.04老年组7218.06±6.614.6529<0.01*AD组8121.17±5.482.352.26<0.05*青年组与老年组，*青年组与AD组，*老年组与AD组(下表相同)表4核仁银染三组患者神经元核仁着色的积分吸光度分组细胞数±st值P值青年组97199.79±102.96老年组72141.43±54.992.67<0.01*AD组81173.24±42.812.0392.12<0.05*结果

15、表明：和青年组相比，老年组和AD组海马神经元核仁着色面积减少，核仁的积分吸光度减弱。但老年组和AD组相比，AD患者海马神经元核仁着色面积相对扩大，核仁积分吸光度相对增强，进一步提示AD时rDNA转录活性区在一定程度上相对扩大，其转录增强。 3讨论AD的主要病理组织学表现为脑内出现神经元纤维缠结、老年斑、神经细胞颗粒空泡变性和Hirrano小体，其中以老年斑和神经元纤维缠结最具有诊断意义，上述改变亦可见健康的老年组，但其数量不同。本组10例AD患者病程最短者3年，最长者9年，除结合临床表现外并经Bodian染色符合病理诊断标准而确诊4，5。对照组青年组、老年组各10例均死于内科疾患，生前无任何神

16、经和精神疾患之表现和体征。脑海马切片经尼氏染色后神经元呈淡蓝色，细胞核呈深蓝色，尼氏体在神经细胞内呈大块或呈颗粒状。近年来用紫外显微分光光度计测量结果证明，尼氏体的吸收光谱与RNA是一致的。在电镜下尼氏体是一些游离的核糖体和粗面内质网，它和神经细胞的功能具有密切的关系，分析核浆比值的变化可以了解神经细胞的功能状态，本组像分析的结果说明老年和AD患者海马神经元功能状态低下的病理基础。进一步说明老年人和AD患者随年龄增长和病程延长，而逐渐出现细胞活性减低、功能减退，其病理基础为细胞的老化、皱缩、退变、最终则发生细胞的死亡。核仁组成区(NORs)是染色体上含有rRNA基因的区段。这些基因在RNA聚合

17、酶I的参与下转录成rRNA前体，它们进而被加工成rRNA6，而核仁为在细胞间期内由于NORs中基因活动而形成的可见结构。现已证实，采用胶银染色技术显示的嗜银物质不是NORs本身，而是银与NORs相关的酸性蛋白质结合，这些蛋白质即是核仁组成区相关AgNORs，这种结合具有高度的特异性。特殊银染色技术可使具有转录活性的或已转录仍具转录活性的rDNA着色，没有转录活性的不着色7，8。故AgNORs是细胞rDNA及其转录水平的一种良好细胞化学标志，AgNORs的数目可反映细胞核和细胞的活性，其面积可反映细胞总体基因的转录活性。我们利用这一方法对青年组、老年组和AD组海马神经元进行了检查。像分析结果说明

18、，和青年组相比，老年组和AD组核仁着色面积减少，积分吸光度减低，提示老年组和AD组海马神经元rDNA转录活性低于青年组。Spencer9及Lezhava10在周围血所培养的淋巴细胞曾观察到此种现象。核糖体基因活性的减少可能是由于rDNA基因在调节和表达方面的变化而引起蛋白质合成的减少。但有趣的是老年组和AD组比较，其核仁着色面积相对扩大，积分吸光密度相对增强，提示AD患者海马神经元转录活性相对增高，其细胞总体基因表达活性相对增强，有些作者在AD患者脑皮层观察到一些形态学的变化，和对照组比较：神经元树突脊在数量上增多，大小上增加；胆碱能纤维则延长曲张，提示此调节代偿现象在人类可能比较发达，因此，

19、海马神经元基因表达活性增强可能代表了一种细胞的防御系统。总之，AD神经元这些形态学上的变化可能是由于海马神经元的患病阶段或由于病理过程中仍然存活而没有影响的神经元的代偿机制所致。作者单位：卢文甫王鲁宁（解放军总医院脑系科100853）范明米瑞发（军事医学科学院基础所）参考文献1Howel WM,Black DA.Controlled silver-staining of neucleolus organizers refions with a protective colloidal developer a 1-step method.Experimentia,1980,36:10142Hub

20、bell HR.Silver stianing as an indicator of active ribosomal genes.Stain Technol,1985,60:2853Jimenez R,Burgos M,Guardia RD.A study of the Ag-staining significance in mitotic NOR's.Heredity,1988,60:1254Mckhann G,Drachmann D,Folstein M et al.Clinical diagnosis of Alzheimer's disease:Report of t

21、he MINCDS-ADRDA work group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease.Neurology,1984,34:9395Richard L D,David MR.Textbook of Neuropathology In:Degenerative diseases of the central nervous system,Pathologic diagnosis of Alzheimer's disease,second.Baltimore.Hong Kong.London.Munich San Francisco.Sydney.Tokyo:Williams and Willins,1991,904-9186Crocker J and Nar P.Nucleolar org