PDTC对压力负荷过度诱导小鼠心肌肥大的防护作用及其机制研究

1、PDTC对压力负荷过度诱导小鼠心肌肥大的防护作用及其机制研究 06-07-01 16:27:00 作者：李跃华，李菁，阙玲俐编辑：studa20【摘要】 目的 观察吡咯烷二硫基甲酸盐（PDTC）对心肌肥大发生发展的影响并探讨其机制。方法 以缩窄小鼠主动脉弓(TAC)诱导的心肌肥大为模型，观察PDTC对心肌肥大发生发展的影响，并采用EMSA检测心肌组织中NF-B结合活性，应用Western blot方法分析心肌组织中phospho-GSK3的表达水平。结果 (1)缩窄小鼠主动脉弓2周后，心脏重量/体重比值与假手术组相比增高48.7% (P0.01)，而且肥大心肌组织中NF-B结合活性和phosp

2、ho-GSK3(Ser9)蛋白表达明显高于假手术组(P0.01)。(2)PDTC可明显减轻TAC诱导的心肌肥大，与TAC模型组相比可以使小鼠心脏重量/体重比值下降16.4%(P0.05)。PDTC可抑制心肌组织中NF-B活性，与TAC模型组相比降低了34.3%(P0.01)，同时亦可抑制心肌组织中GSK3(Ser9)磷酸化水平，p-GSK3(Ser9)/ GSK3比TAC模型组降低了22.1%(P0.05)。结论 PDTC可以通过抑制NF-B结合活性和GSK3（Ser9）磷酸化水平延缓心肌肥大的发生发展。 【关键词】 心肌肥大；吡咯烷二硫基甲酸盐；核因子B； 糖原合成激酶-3 【Abstrac

3、t】 Objective To investigate the role and mechanism of PDTC on the development of cardiac hypertrophy in vivo.Methods PVB/N mice were employed and cardiac hypertrophy was induced by transverse aortic constriction for 2 weeks.Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to determine NFkB bindi

4、ng activity with nuclear proteins extracted from heart tissues； Western blots were performed to examine the phosphorylation of GSK-3. In a separate experiment， PDTC was administered into mice subjected to transverse aortic constriction for 2 weeks.Results (1)Transverse aortic constriction(TAC) signi

5、ficantly increased the ratio of HW/BW. Two weeks after TAC， the ratio of HW/BW was significantly increased by 48.7%(P0.01)， compared to age-matched sham control. NFkB binding activity and the level of phospho- GSK-3(Ser9) were significantly increased at 2 weeks following TAC compared to age-matched

6、sham control (P0.01).(2)Administration of PDTC into TAC mice for 2 weeks， significantly reduced the ratio of HW/BW by 16.4%(P0.05)， compared to non-treated TAC mice. NFkB binding activity was significantly reduced by 34.3% (P0.01) in the hearts administered with PDTC for 2 weeks， compared to non-tre

7、ated TAC group. In addition，administration of PDTC also decreased the level of phospho- GSK-3(Ser9)/ GSK-3 by 22.1%(P0.05) compared to non-treated TAC group.Conclusion PDTC inhibit the NFkB binding activity and the level of phospho- GSK-3(Ser9) in hypertrophic heart tissues and thereby attenuates th

8、e development of cardiac hypertrophy. 【Key words】 cardiac hypertrophy；pyrrolidine dithiocarbamate；NF-B；GSK-3 心肌肥大是心脏对生物机械牵张和神经体液刺激的一种主要反应。虽然早期心肌肥大是心脏维持有效心输出量的一种代偿性机制，但持久的心肌肥大会导致心脏进入失代偿阶段，继而发生不可逆转的心肌肥大和扩张，心肌收缩力下降，导致心力衰竭1，2。调控心肌细胞肥大的详细分子机制及关键的信号转导通路迄今尚未阐明。最近的研究提示核因子-B（nuclear factor kappa B，NF-B）信号通路可

9、能在心肌肥大的发生发展中起着重要作用2，3。吡咯烷二硫基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamate ，PDTC）是NF-B抑制剂，通过其抗氧化作用可抑制肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）诱导的反应性氧自由基的产生和NF-B活性4。Dechend等也报道抗氧化剂可通过抑制NF-B活性而解除Ang所诱导的心肌细胞肥大性反应5。然而，Hayakawa等报道PDTC抑制NF-B活性与抗氧化功能无关6。为此，本研究以压力负荷增加诱导的小鼠心肌肥大为模型，进一步探讨PDTC抑制NF-B活性的机制，并观察PDTC对心肌肥大发生发展的影响。 1 材料与方法

10、1.1 材料 药品与试剂：水合氯醛、PDTC(Sigma 公司产品)；NF-B寡核甘酸、T4 Polynucleotide kinase、Gel Shift Banding 5xBuffer(Promega公司产品)；Pierce BCA蛋白分析试剂(Pierce化学公司产品)；-32pATP(3000Ci/mmol)(Amersham公司产品)；p-GSK3(Ser9)、 anti-Rabbit IgG HRP-Linked抗体(Cell Signaling公司产品)；GSK3(H-76)(Santa Cruz Biotechnology公司产品)；ECL化学发光试剂盒(Amersham，P

11、iscataway，NJ)；Kaleidoscope Prestained Standards蛋白质Marker(BIO-RAD公司产品)；SDS、丙烯酰胺、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)(Sigma公司产品)。实验动物：雄性PVB/N小鼠，美国东田纳西州大学实验动物中心提供。 1.2 方法 小鼠心肌肥大模型的建立 PVB/N小鼠周龄达67周时，经水合氯醛麻醉后，通过气管插管与啮齿动物呼吸机连接，进行人工通气。于胸部左侧第23肋间打开胸腔，分离主动脉弓并在其下穿一丝线，按统一标准使主动脉缩窄(Transverse aortic constriction，TAC)，关闭胸腔。假手术组除了不

12、进行TAC外，其余手术程序完全与模型组相同。 实验分组及给药 实验分为3组：(1)假手术组：假手术组除了不进行主动脉缩窄外，其余手术程序完全与模型组相同；(2)TAC模型组：缩窄主动脉弓二周；(3)PDTC处理组：小鼠于TAC前1h开始腹腔注射PDTC，剂量120mgkg-1d-1，持续2周。 样本的收集与检测 (1)心脏重量/体重比值：TAC 2周后，用水合氯醛麻醉小鼠后，取出心脏，统一标准修剪心脏、称重，计算心脏重量/体重比值，作为评估心肌肥大的指标。取左心室，-70保存待用；(2)胞浆、胞核蛋白的提取：左心室肌组织中加入Buffer A充分匀浆，在冰上放置1530min，再加入适量的10

13、%NP-40，混匀1min，4、10000r/min离心3min，上清即为胞浆蛋白。沉淀用Buffer C悬浮混匀，冰上放置12h，不时振动，再在4、14，000转/min离心10min，上清即为核提取物。采用Bradford方法，以BSA作标准测定胞浆和胞核蛋白浓度。胞浆和胞核蛋白提取物于-80保存备用；(3)NF-B活性的检测：采用凝胶迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay， EMSA）方法。本实验中NF-B同序寡核苷酸探针如下：3-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5；5-AGT TGA GGG GAC TTT CC

14、C AGG C-3，采用T4寡核苷酸激酶法以-32P-ATP（3000Ci/mmol）标记探针。核蛋白-DNA探针结合反应体系为：等量核蛋白提取物（30g），35 fmols-32p标记的双链NF-B寡核苷酸，反应总体积为15l。室温静置20min后加入加样缓冲液，经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。干胶后，-80放射自显影，图像采用Bio-Rad公司的phosphor-图像分析系统进行定量分析。(4)Western blot分析：经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离待测蛋白，并将其转移至硝纤膜上，用封闭缓冲液(5%脱脂奶粉，0.05%Tween-20 TBS) 封闭1h，然后

15、与相应的特异性抗体孵育，4过夜。次日用封闭缓冲液漂洗3次，再与辣根过氧化物酶标记的相应二抗于室温孵育1h后，用0.05%Tween-20 TBS 漂洗3次。按0.125ml/cm2膜加上化学发光试剂，静置12min后，压X光片作为显影记录。采用phosphor-图像分析系统，进行定量辉度扫描分析。 统计学处理 本实验中所有数据均采用xs表示，经方差齐性检验后，组间分析采用t检验。 2 结果 2.1 PDTC降低TAC小鼠心脏重量/体重比值 小鼠TAC 2周后，心脏重量/体重比值明显增加，与假手术对照组相比增加了48.7%6.781.14(mg/g) VS. 4.560.34(mg/g)，n=10，P0.01。PDTC处理组与TAC模型组相比可以使小鼠心脏重量/体重比值下降16.4%5.670.49 (mg/g) VS. 6.781.14