年执业药师药学专业知识药物分析部分教材考点

1、第五章 分光光度法v 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，进行定性、定量分析的方法。§1. 紫外-可见分光光度法紫外光区 200-400 nm;可见光区 400-760 nm。紫外-可见吸收光谱：物质吸收紫外和可见光区的电磁波而产生的吸收光谱跃迁：物质分子的价电子吸收了光的能量，由低能量的基态转变为高能量的激发态的过程。跃迁发生的条件：光子所提供的能量与跃迁所需能量相当。不同结构的物质分子能级差不同，(吸收的能量不同)电子跃迁不同，可产生不同紫外-可见吸收光谱，可进行定性分析鉴别的依据。一、 基本原理1.光的吸收定律Lambert-Beer定律

2、 吸收光谱法的基本定律一定浓度范围内，一定条件下，被该物质吸收的光量(吸光度A)与该物质溶液的浓度(C)和液层厚度(L)成正比： 药物定量测定的依据 A = -lg ( I/I0 )= - lg T = ECL物质分子对特定波长的光的吸收程度与分子的结构、溶液浓度、液层厚度(光路长度)有关。2.吸收系数1)A = ECL公式中，E为物质的物理(特性)常数。E越大，说明物质对某波长的光的吸收能力越强E®定性、定量依据。2)两种表示方法：C单位为“mol/L” 时，E为摩尔吸收系数，用e 表示;当C用“g/100ml”为单位时，E为比吸收系数或百分吸收系数，用E1%1cm表示。3)E1%

3、1cm的物理意义：吸光物质C为1% ，L为1cm时，在一定条件下(波长、溶剂、温度一定)测得的吸光度A。二、紫外-可见分光光度计(一)基本结构：光源 紫外：氘灯或氢灯;可见: 钨灯或卤钨灯单色器 色散元件(光栅或棱镜);狭缝吸收池 紫外: 石英; 可见: 玻璃, 石英检测器 光电池、光电管、光电倍增管、光二极管阵列检测器数据记录和处理(二)仪器的校正和检定(1) 波长的校正 汞灯或氘灯的特定谱线为参照或钬玻璃的特定波长(2)吸光度的准确度检定 用重铬酸钾的硫酸溶液(3)杂散光的检查 一般来源于光学仪器表面的瑕疵三、 吸光度的测定要求1. 溶剂 应符合规定2. 作空白试验校正 目的：消除溶剂和吸

4、收池的影响3. 测定波长的检查 一般以吸光度最大的波长 max为测定波长，吸收峰的波长应在该品种规定波长的±2%以内，否则应考虑供试品的真伪、纯度及仪器波长正确性。影响波长检查结果的条件有：供试品的真伪与纯度、溶剂的种类 、仪器波长的正确性4. 供试品溶液浓度 使吸光度在0.3-0.7范围内5. 仪器狭缝宽度的选择 调至供试品溶液的吸光度不再增加为止四、应用(一)鉴别 中国药典所采用方法：1. 核对吸收光谱的特征参数：最大吸收波长lmax，吸收系数E1%1cm;吸光度 A2. 比较吸光度比值： Al1 /Al2®El1/El23. 比较吸收光谱的一致性(二)杂质检查：依据：

5、药物与杂质的结构不同，故吸收光谱也不同。1. 药物在紫外可见光区没有明显吸收，所含杂质有较强吸收¾¾少量杂质可用光谱检索出来。2. 药物有较强吸收;杂质无吸收或很弱¾E(e)¯ 或杂质有更强吸收¾¾ E(e)规定吸光度的上下限可在一定程度上控制杂质的量(三)含量测定：紫外分光光度法用于含量测定的方法有三种：前三种方法(1)对照品比较法： AR/AX=ECRL / ECXL =CR/ CX Þ CX=(AX/AR)CRÞ供试品溶液与对照品溶液浓度C及测定条件应一致，E、L相等(2)吸收系数法(绝对法)： A=E1%1

6、cm CL ÞC=A/(E1%1cmL)对仪器须进行严格的校正和检定(波长的准确度、狭缝宽度符合要求)，否则影响准确度(3)计算分光光度法 如双波长分光光度法、导数光普法主要用于消除样品中干扰组分的干扰(4)比色法(属于可见分光光度法) 显色剂显色后测定§2. 荧光分析法一、基本原理(一)荧光的产生：某些物质受紫外光或可见光照射激发后，能发射出比激发光波长更长的荧光;除去激发光源，荧光立即熄灭。荧光的能量小于激发光的能量，波长则长于激发光。(二)荧光光谱荧光激发光谱¾¾荧光的激发光波长为横坐标;发射光强度为纵坐标荧光发射光谱¾¾激发光

7、波长和强度不变，荧光物质的不同荧光波长为横坐标;发射光强度为纵坐标激发光波长、强度不变，测定用溶剂、温度等条件一定时，荧光强度与物质浓度成正比定量依据。第六章 色谱法l 色谱法：是一种物理或物理化学分离分析方法，将混合物中各组分分离后在线或离线分析的方法。是分析混合物的最有效的手段。l 应用范围：定性鉴别、纯度检查、含量测定。§1. 概论一、基本原理色谱过程是物质分子在相对运动的两相(固定相和流动相)间分配平衡的过程，可用分配系数(K )和容量因子(k)来描述。混合物中，若两组分的 K或 k不等，则被流动相携带的速度不等，产生差速迁移，从而被分离。1. 分配系数K：组分在固定相和流动

8、相之间达到分配平衡时的浓度之比。K = Cs/CmK：与组分自身特性、固定相、流动相的性质及温度有关2. 容量因子k (质量分配系数)：达分配平衡后，组分在固定相和流动相中的质量之比。k = Ws/Wmk与K的关系： k = Cs·Vs/(Cm·Vm )= K(Vs/Vm)k: 与组分、固定相、流动相的性质及温度有关;还与两相体积有关。不同组分之间的 k 差异是色谱分离的先决条件3. 色谱过程方程 tR=t0(1+K·VS/Vm)=t0(1+k)二、分类：中国药典将色谱法分为纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、电泳法1. 按分离原理分类：吸

9、附色谱法：固定相为固体(吸附剂) 如GSC、LSC分配色谱法：固定相为液体 如GLC、LLC离子交换色谱法：固定相为离子交换树脂，适用于离子型的有机物或无机物的分离分析分子排阻色谱法(空间排组色谱法、凝胶色谱法)：固定相为多孔性填料(凝胶)2. 按操作形式分类：柱色谱法、平面色谱法、电泳法§2. 薄层色谱法 thin layer chromatography TLC一、基本原理：分离依据：难被吸附化合物移动快，易被吸附化合物移动慢些，产生差速迁移®KAKB®分离二、常用固定相吸附TLC法的固定相为吸附剂，最常用硅胶，其次有硅藻土、氧化铝、微晶纤维素、聚酰胺。1.

10、硅胶：SiO2·xH2O， 具有硅氧交联结构、表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基是活性基团。含水量，活性。活化：105 110加热30 min，吸附力增强。TLC常用硅胶G、硅胶GF254、硅胶H和硅胶HF254。2. 氧化铝：有碱性、中性和酸性三种3. 聚酰胺：表面有酰胺基，与酚、羧酸、氨基酸等形成氢键三、操作方法 薄层板的制备：涂布厚度0.20.3 mm。点样与展开：点样的样点一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，样点直径为24mm。一块板可以点多个样点，展开时，薄层板浸入展开剂的深度为距薄层底边0.51.0cm(三)检视荧光薄层板：荧光淬灭法普通薄层板 有色 直接检视;无色

11、显色检视通用型显色剂：碘、硫酸溶液、荧光黄溶液(四)色谱系统适用性试验目的： 使斑点的检测灵敏度、比移值(Rf)和分离效能符合规定1.检测灵敏度2.比移值(Rf) 基本定性参数 ： Rf = l / loRf 最佳范围0.30.5;可用范围0.20.8。3. 分离效能 分离度(R)表示 R=2d /(W1+W2)四、应用：TLC法主要用于药品的鉴别或杂质检查。(一)鉴别：将同浓度的供试品溶液、对照品溶液点在同一薄层板上¾®展开显色后¾®供试品、对照品颜色与比移值Rf均一致¾®可认为供试品与对照品是同一物质。(1)与对照品比较Rf值 (

12、2)与结构相似的物质比较Rf值(二) 杂质检查1. 杂质对照品法： 杂质斑点颜色与杂质对照品斑点比较，不得更深¾®可认为未超过规定的杂质最高限量。2.自身稀释对照法(高低浓度对比法) 适用于得不到杂质对照品的情况供试品溶液按限度规定稀释成另一低浓度溶液或系列溶液，为对照溶液。供试品杂质斑点与相应的自身稀释对照液所显主斑点比较，颜色不得更深§3. 高效液相色谱法(HPLC)high performance liquid chromatography HPLC一、基本原理样品中各组分在固定相与流动相之间分配，由于各组分的分配系数不等，他们按分配系数大小的顺序依次被流动

13、相带出色谱柱。K小的组分先流出，K大的组分后流出。(一) 基本概念1.色谱图和色谱峰色谱图或流出曲线：色谱响应信号随时间的变化曲线色谱峰：流出曲线上的突起部分。正常：正态分布曲线;不正常：拖尾峰和前延峰。色谱峰正常与否用拖尾因子衡量。每个组分的色谱峰可用三项参数说明峰高或峰面积：用于定量。 峰宽W：用于衡量柱效峰位：用保留值tR表示，用于定性。2. 基线在色谱分离过程中，没有组分流出时的流出曲线。反映色谱系统(主要是检测器)的噪音水平3. 保留值保留时间( tR )、死时间( t0 )、 调整保留时间(tR ´): tR ´= tR - t0相对保留值(r)：即选择性因子，

14、 r2,1= tR2´/ tR1´= k2/k14. 色谱峰区域宽度 越小，流出组分越集中，有利于分离标准差( )、半高峰宽( Wh/2)、峰宽(W)(二) 塔板理论色谱柱踏板数大于103时，流出曲线趋于正态分布。理论踏板高(H)可由柱长(L)和理论踏板数 n 计算：H = L /n n = 5.54 (tR/Wh/2)2记录纸速(mm/min)：转换分子、分母单位相同的参数。联系时间单位与长度单位。H 和 n 都是柱效指标，可用于评价柱效高低。 塔板数越多，塔板高度越小，柱效越高例：用HPLC法测得某组分的保留时间tR为1.5 min，半峰宽Wh/2为0.2 cm;记录纸

15、速为2.0 cm/min，则柱效为：A. 1246B. 2492C. 623D. 1800E. 311n=5.54(tR/ Wh/2)2 =5.54(1.5×2.0/0.2)2 =1246(三) 速率理论 Van Deemter方程，范氏方程：H = A + B/u + CuA为涡流扩散项，B为纵向扩散系数，C为传质阻抗项HPLC中范式方程简化为： H = A + Cu二、高效液相色谱仪(一)仪器的基本结构高压输液泵、色谱柱、进样阀、检测器(二)检测器的类型和适用范围1. 选择性检测器：也称浓度型检测器，包括紫外检测器、光二极管阵列检测器DAD、荧光检测器、电化学检测器和质谱检测器。

16、(1)紫外检测器：最常用。适于有共轭结构的化合物如芳香化合物、核酸及甾体激素等。(2)光二极管阵列检测器 diode-array detector, DAD(3)荧光检测器：仅适用于在流动相条件下具有荧光或经衍生转化为具有荧光的化合物(4)电化学检测器： 仅适用于在流动相条件下可发生氧化-还原反应的化合物的检测。(5)质谱检测器：主要应用于大分子物质的检测，如蛋白质、多肽等，以及色谱峰的纯度或原料药中的杂质检查。2. 通用型检测器：也称质量型检测器，包括示差折光检测器和蒸发光散射检测器(ELSD)。ELSD 仅适用于UV检测困难的物质的分析，如糖类和脂质等，以及药物杂质的确认。三、液固吸附色谱

17、法 LSCl 分离原理：按被分离组分的分子(溶质分子)与流动相分子(溶剂分子)争夺吸附剂表面活性中心的吸附能力的差别而分离。l 硅胶为吸附色谱法最常用的固定相。四、液液分配色谱法 LLC(一)正相分配色谱法：流动相极性<固定相极性。主要用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。反相分配色谱法：流动相极性>固定相极性。主要用于分离非极性至中等极性物质。(二)LLC的固定相 最常用的固定相是化学健合相。(1)非极性健合相：十八烷基硅烷健合硅胶(ODS，C18)、辛基硅烷健合硅胶(C8)，在反相HPLC中最为常用。(2)极性健合相：常用氨基和氰基硅烷键合相，即可用于正相色谱法，也

18、可用于反相色谱法。多用于正相HPLC。五、色谱系统适用性试验目的：检查色谱系统在实验条件影响下是否符合要求在各品种项下规定的色谱条件下，除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、色谱柱长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变。以适应具体的色谱系统并达到色谱系统适用性试验的要求。一、系统适用性试验色谱系统适用性试验通常包括：理论踏板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。(1)色谱柱的理论踏板数(n) n=5.54 (tR /Wh/2)2 tR， Wh/2统一单位如测得n低于规定，应改变柱长或载体性能、重

19、填色谱柱等以求达到。(2)分离度 (R) R=2(tR2-tR1)/(W1+W2) 定量分析时R ³ 1.5记录纸速：转换分子、分母单位相同的参数。考题 A型题：测得两色谱峰的保留时间tR1=6.5min，tR2=8.3min，峰宽W1=1.0min，W2=1.4min，则两峰分离度R为A、0.22B、1.2C、2.5D、0.75ÖE、1.5(3)重复性：对照品溶液连续进样5次，其峰面积测量值的 RSD 2.0%配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加规定量的内标溶液，配成三种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其RSD 2.0%(4)拖尾因子(

20、T)： T = W0.05h/2d1 T应在0.95 1.05之间六、应用(一)鉴别 供试液主峰的保留时间与对照液一致(二)杂质检查 中国药典用HPLC杂质检查方法有5种1)内标法加校正因子校正因子( f ) =(As /Cs) / (AR/CR) 含量 (Cx) = f · Ax / (AS /CS )2)外标法 含量 (Cx) = CR · (Ax / AR)3)加校正因子的主成分自身对照法：对照溶液为供试品溶液的稀释溶液4)不加校正因子的主成分自身对照法 无杂质对照品5)面积归一化法(三)含量测定 内标法加校正因子法、外标法§4. 气相色谱法 gas chr

21、omatography， GC一、基本原理采用气体流动相;不适于难挥发和热稳定性差的物质的分析;各组分按K大小顺序依次被载气带出色谱柱产生分离二、气相色谱仪(一)载气源 FID多用氮气或氦气为载气，氢气为燃气，空气为助燃气。TCD多用氦气或氢气为载气;ECD多用氮气或氩气为载气。(二)进样方式 可分为溶液直接进样、顶空进样(三)色谱柱 填充柱或毛细管柱(四)柱温箱 控温精度在±1(五)检测器：1.火焰离子化检测器(FID)氢气为燃气，空气为助燃气。检测器温度应高于柱温，并不低于150®¾防水气凝结，(否则倒流)，通常为 250 - 350 2. 氮磷检测器NPD

22、适于含氮、磷元素的药物3. 火焰光度检测器FPD 适于含氮、硫元素的药物4. 电子捕获检测器ECD 主要用于含卤素药物5. 质谱检测器MS 能给出相应的结构信息6. 热导检测器 TCD 检测组分的浓度变化浓度型：TCD、电子捕获检测器ECD(六)数据处理系统三、常用固定液与载体1. 常用的固定液：常用的鲨鱼烷是标准非极性固定液硅氧烷类 ：SE-30、SE-54、OV-17、OV-25等醇类：聚乙二醇(PEG)是最常用的固定液之一2. 载体(担体) 作用：承载固定液为化学惰性的多孔性微粒，常用硅藻土型载体：红色载体和白色载体。3. 毛细管色谱柱：开管型毛细管柱和填充型毛细管柱四、色谱系统适用性试验在各品种项下规定色谱条件下，除检测器种类、固定液品