肺癌全基因组关联研究的进展

1、肺癌全基因组关联研究的进展#*510152025303540摘要：由于持续增长的烟草消费和严重的环境污染，我国多数地区的肺癌发病率和死亡率一直呈上升趋势，成为严重危害我国居民健康和生命的主要疾病之一。肺癌的发生发展是环境因 素 与 遗 传 因 素 共 同 作 用 的 结 果 ， 遗 传 因 素 包 括 单 核 苷 酸 多 态 性 (Single nucleotidepolymorphism，SNP)。过去以通路为基础的 SNP 研究策略存在多种不足，导致结果重现性差，相比之下，全基因组关联研究(Genome-wide association study，GWAS)则具有很多的优势，发现了很多肺

2、癌的遗传易感性位点。本文即对肺癌全基因组关联研究的进展做一综述。关键词：流行病学；肺癌；全基因组关联研究中图分类号：R18Progress in Genome-wide Association Studies of LungCancerDong Jing, Cao Songyu, Ma Hongxia, Jin Guangfu, Hu Zhibin, Shen Hongbing(Department of Epidemiology and Biostatisticschool of Public Health, Nanjing MedicalUniversity, Nanjing 211166

3、)Abstract: In China, the morbidity and mortality of lung cancer have been increasing rapidly in lasttwo decades, which is believed to be mainly due to continuous increases in tobacco consumptionand environmental pollution. The occurrence mechanism of lung cancer is related to alteration ofenvironmen

4、tal and genetic factors, including single nucleotide polymorphisms. Compared to theresearch strategy of candidate gene , genome-wide association studies has much more advantages.This paper summarized the development and progress in lung cancer genome-wide associationstudies.Key words: epidemiology;

5、lung cancer; genome-wide association study0 引言肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，在工业化国家和我国许多城市已位居全部恶性肿瘤死因的首位。由于持续增长的烟草消费和环境污染，我国多数地区的肺癌发病率和死亡率一直呈上升趋势，成为严重危害我国居民健康和生命的主要疾病之一。流行病学研究表明，肺癌的发生是环境因素和遗传因素共同作用的结果，尽管 80%以上的肺癌可归咎于烟草暴露，但在相同的烟草暴露下，仅不到 20%的吸烟者发展为肺癌，提示不同个体对肺癌存在遗传易感性，主要是单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)。过去

6、 10 余年间，研究者在肺癌遗传易感性方面进行了大量的关联研究，由于早期基因分型技术不成熟和基因组变异信息缺乏，关联研究主要是采用候选基因策略，即将研究的重点集中于影响肺癌发生的重要通路/基因，如代谢、DNA 修复、凋亡和细胞周期调控等通路，但是由于样本量较小、研究设计参差不齐、研究结果缺乏验证，导致这些研究结果重现性差，真正与肺癌易感性建立明确关联的基因变异很少。尽管这些研究结果对于阐明肺癌的遗传易感机制还有相当大的-1-差距，但其对于整个相关研究领域的推动是极其显著的，技术方法和研究资源均在短短 10多年时间内发生了巨大的变化。随着人类基因组图谱(HGP)和单倍型图谱(HapMap)的构建

7、，相关基因多态数据的不断完善，能够覆盖整个候选基因/区域，甚至是全基因组的标签 SNP45505560657075(Tagging SNP，tSNP)研究策略得到研究者推崇。全基因组关联研究(Genome-wide associationstudy，GWAS)的出现为肺癌等复杂性疾病遗传易感性研究提供了强有力的工具。GWAS 一般采用高通量的基因分型平台，在基因组范围内根据连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)原理选择标签位点进行检测，一般需要同时检测几十万甚至上百万的位点，这种设计的特点是没有预设的研究假设(hypothesis free)，所采用的病例-对照研究

8、样本量较大(一般首期筛检需 1000 对以上)，并要求应用多个独立的研究进行后期的验证。目前，已经报道了 15 个肺癌易感位点/区域，预计近几年将会有更多的研究结果陆续发表。本文以肺癌 GWAS 研究为主线，结合我们当前进行的一些工作，总结肺癌 GWAS 的研究进展。1 肺癌 GWAS 研究确定的易感区域1.1 染色体 15q25 区域2008 年 4 月，来自国际癌症研究署(International Agency for Research on Cancer, IARC)、美国 MD 安德森肿瘤中心和冰岛 DeCode 遗传研究所的三个课题组同时报道了肺癌 GWAS的结果，发现染色体 15

9、q25 区域是肺癌的易感区域1-3。Hung 等在欧洲人群(IARC-GWAS)进行了两阶段筛选，首先利用 Illumina HumanHap300 平台对来自欧洲的 1,989 例肺癌病例和2,625 例对照检测了 317,139 个标签 SNP (覆盖了欧洲人群已知常见 SNP 的 80%)。经过质量控制后分析显示，位于染色体 15q25 区域的两个 SNP 与肺癌的关联最强(rs8034191：P=910-10； rs1051730： P=5 10-9)，研究者经过对该区域进一步分析后选择 rs8034191 和rs16969968 进行了第二阶段的独立验证(5 个病例对照研究，包括 2

10、,513 例病例和 4,752 例对照)。研究结果表明，rs8034191 和 rs16969968 在 5 个独立的研究中均存在显著关联，合并全部研究对象后发现 rs8034191 可显著增加肺癌发病风险(OR=1.30，P=510-20)，rs16969968与 rs8034191 存在高度 LD (r2 = 0.92)，因此效应类似1。Amos 等在美国人群中进行的GWAS(Texas-GWAS)采用了不同的研究设计，他们为了降低吸烟行为的混杂效应，第一阶段选择的研究对象均为吸烟者，并根据吸烟行为对肺癌病例和对照进行例频数匹配(1,154 病例/1,137 例对照)。第二阶段选择第一阶段

11、最显著的 10 个位点在来自德州的 711 例病例/632例对照和来自于英国的 2,013 例病例/3,062 例对照中进行了验证，最终发现的两个有意义的位点 rs1051730(P=7.010-18)和 rs8034191(P=3.1510-18)均位于染色体 15q25 区域，且存在高度 LD (r2 = 0.88)，与 IARC-GWAS 的研究结果一致2。值得关注的是，冰岛 deCODE遗传研究所的 Thorgeirsson 等首先对冰岛的 10,995 吸烟者进行了吸烟行为相关的 GWAS 研究(deCODE-GWAS)，发现以 rs1051730 为代表的 15q25 区域遗传变异

12、与吸烟量和尼古丁成瘾存在高度关联，他们进一步对来自于冰岛、西班牙和荷兰的 1,024 例肺癌病例和 32,244例对照进行了肺癌 GWAS 研究，发现该位点同样可以显著影响肺癌的发病风险，其人群归因危险度为 18%，并提示该区域与肺癌的关联可能是通过吸烟行为间接导致的3。同年 9 月，Liu 等又利用 Affymetrix 500K 和 Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array6.0 芯片对 194 例家族性肺癌患者和 219 例对照进行了检测，并在为了减少吸烟和年龄对肺-2-癌发病可能的影响，他们将年长者中的吸烟者选作为对照。经过分析发现，染色体 15q2

13、580859095100105110115区域周围有几簇很高的信号，且这些位点之间连锁不平衡程度很高，分处于几个染色体区段(“block”)内，其中也包括前期报道的 2 个易感位点 rs8034191 和 rs1051730(P 值分别为 3.7410-4 和 2.9010-4)。值得关注的是，在家族性肺癌中，这两个 SNP 的效应要大于散发性肺癌，OR 值分别为 3.84 和 3.434。同年 12 月，Wang 等利用 Illumina HumanHap550 芯片对1,952 名英国肺癌患者和 1,438 名健康人的 511,919 个 SNPs 进行了 GWAS 分析(UK-GWAS)

14、，发现最显著的信号仍然落在 15q25.1 区域，关联最显著的位点为 rs8042374(P=7.7510-12)5。该研究是对前期几个 GWAS 研究的又一验证。上述研究发现的肺癌易感区域染色体 15q25 区域含有 6 个已知的蛋白编码基因，包括 3个尼古丁乙酰胆碱受体基因 CHRNA3、CHRNA5 和 CHRNB4，铁元素敏感反应元件 IREB2、DNA 修复通路基因 PSMA4 以及功能尚不明确的 LOC123688。CHRNA3、CHRNA5 和CHRNB4 等基因能够在大脑表达，对控制吸烟行为具有重要作用；它们还可以在肺上皮表达，并通过与烟碱或烟草致癌代谢物结合发挥信号转导作用，

15、进而影响细胞增殖甚至肿瘤的发生6。但是，欧美人群肺癌 GWAS 分析对吸烟行为进行校正后该区域仍然与肺癌存在关联1, 2，这又似乎表明该区域是肺癌的独立易感区域。因此，目前对于该区域遗传变异究竟如何在肺癌发生中发挥作用的尚需进一步探讨。1.2 染色体 5p15 区域2008 年 12 月，McKay 等在他们前期进行的 IARC-GWAS 基础上，扩大样本，在另外1,291 例病例和 1,561 例对照中进行了全基因组芯片检测，最后芯片筛选阶段的对象包括3,259 例病例和 4,159 例对照，经过质量控制后，研究者最后选择了 2,971 例病例和 3,746 例对照的 315,194 个 S

16、NPs 进行分析，结果显示，位于染色体 5p15.33 区域的的 4 个 SNP 位点P0.68)，另一个位点 rs2736100 与 rs402710 仅存在微弱 LD (r2 =0.026)。为了验证 GWAS 研究结果，研究者对 rs402710 和 rs2736100 这两个 SNP 位点进行独立验证，研究对象是来自四个病例 -对照研究的 2,899 例肺癌病例和 5,573 例对照(IARC-Replication)，验证结果与 GWAS 结果一致。Logitic 回归模型显示，rs402710 和rs2736100 是肺癌的独立易感位点，两者均可显著增加肺癌的发病风险7。同期，Wa

17、ng 等在英国人群进行的肺癌 GWAS (UK-GWAS)检测了包括 1,952 例病例和1,438 例对照在内的 511,919 个 SNP，研究者同时结合 IARC-GWAS 和 UK-GWAS 的数据进行了 meta 分析，并将研究结果在另一项英国人群研究(2,484 例病例和 3,036 例对照)中进行了独立验证(UK-Replication)，最终研究者也发现了染色体 5p15.33 区域是肺癌易感区域，他们发现的易感位点 rs401681(P=7.9010-9)与 IARC-GWAS 研究中发现的易感位点 rs402710存在高度 LD (r2 = 0.66)5。rs2736100

18、 位于 TERT 基因第 1 内含子，而 rs402710 位于 CLPTM1L 基因第 9 内含子，其所在的 LD 区段包括 TERT 基因启动子区和 CLPTM1L 基因的整个编码区。TERT 基因编码的端粒酶逆转录酶(reverse transcriptase)是人类端粒酶(telomerase)的重要组成部分8，在维持端粒的稳定中发挥重要作用9。CLPTM1L 是一种顺铂耐药相关基因，其编码蛋白可以诱导顺铂(cisplatin)敏感细胞发生凋亡10，其在肺组织中表达稳定，但在早期非小细胞肺癌组-3-织中表达增高11，其可能通过诱导受到毒害的肺细胞发生凋亡发挥生物学效应。1.3 染色体

19、6p21 区域在 Wang 等进行的 UK-GWAS 研究中，除染色体 15q25 和 5p15.33 外，他们还发现染色120125体 6p21.33 区域 SNP rs3117582 和 rs3131379 与肺癌发病风险存在显著关联，由于二者存在高度 LD (r2 = 0.99)，他们只对 rs3117582 在 2,484 例病例和 3,036 例对照中进行了验证，结果发现其变异等位基因可显著增加肺癌的发病风险(P=4.9710-10)5。rs3117582 和 rs3131379 分别定位于 BAT3(内含子 1)和 MSH5 基因(内含子 10)，前者与凋亡相关，通过调节 P53

20、乙酰化在 DNA 损伤中发挥作用12；后者参与 DNA 错配修复(mismatch repair，MMR)及减数分裂重组，在肺癌发生中发挥重要作用13。2 不同特征人群的肺癌 GWAS 研究2.1.1不同种族人群上述肺癌 GWAS 研究报道了染色体 15q25、5p15 和 6p21 区域与欧美人群肺癌易感性有关，但是遗传易感性在不同种族人群中既有共性也有特殊性。例如，我们对上述报道的欧美130135140145150人群肺癌易感区域 15q25 在中国人群中进行了研究，结果表明，高加索人群的易感位点(15q25： rs8034191、 rs16969968 和 rs1051730)在亚洲人群

21、中频率远低于高加索裔人群(MAF=0.433、0.425 和 0.400)，MAF 均小于 0.05，不是亚洲人群的易感位点；相反，我们发现了位于该区域的 4 个中国人群高频肺癌易感位点(rs2036534、rs667282、rs12910984 和rs6495309)，其中 rs6495309 可能通过转录抑制机制调控 CHRNA3 基因启动子转录表达，是肺癌的潜在致病位点14，而染色体 6p21.33 区域的 2 个位点，BAT3 rs3117582 和 MSH5rs3131379 在亚洲人群中不存在多态，提示在不同种族人群中开展肺癌 GWAS 的重要性和必要性。2010 年，Yoon 等

22、利用 Affymetrix Genome-wide Human SNP array 5.0K 芯片检测了来自韩国的 621 例 NSCLC 病例和 1,541 例对照上 246,758 个 SNP，他们选择 P1.010-4 的 168个 SNP 在 804 例病例和 1,470 例对照进行了验证，发现染色体 3q29 区域 SNP rs2131877 与肺癌易感性显著相关(P=2.4310-8)15。2011 年 7 月，本课题组发表了第一篇中国汉族人群肺癌 GWAS 研究。研究采用大样本多阶段的病例-对照研究设计，对 2,383 例肺癌病例和 3,160 例对照全基因组范围内 906,70

23、3个 SNP 进行了芯片扫描。经过严格的质量控制，选择 P1.010-6 的位点在在 6,313 例病例和 6,409 例对照中进行了两阶段验证，发现了 4 个染色体区域的遗传变异(5p15 区域 SNPrs2736100 和 rs465498；3q28 区域 SNP rs4488809；13q22 区域 SNP rs753955；22q12 区域SNP rs17728461 和 rs36600)与中国人群肺癌发病显著相关，其中，13q22 区域 SNP rs753955、22q12 区域 SNP rs17728461 和 rs36600 是中国人群特异性的肺癌易感区域16。上述易感位点涉及

24、TP63、TERT、CLPTM1L、MIPEP、TNFRSF19、MTMR3、HORMAD2、LIF 等基因，这些基因与致癌物的代谢、DNA 损伤修复、细胞增殖与凋亡、免疫应答等相关。2.1.2不同吸烟状态人群吸烟是肺癌发生较为明确的危险因素，约 80%以上的肺癌可归咎于烟草暴露。前期的-4-肺癌 GWAS 发现 nAChRs 基因簇(CHRNA3、CHRNA5 和 CHRNB4)基因遗传变异与肺癌的发生存在关联1-3。其中，Thorgeirsson 等的研究发现该基因簇的 SNP 与吸烟量和尼古丁的155依赖有关，由此推断这些基因与肺癌的关联是通过吸烟介导的3。而另外 2 个研究发现该区域

25、SNP 与吸烟行为没有关系，认为这些 SNP 可直接影响肺癌的发生1, 2。但 Spitz 等的研究发现该基因簇区域与吸烟行为和肺癌都存在关联，而且更倾向于直接影响肺癌的发病风险17。早期研究者采用候选基因研究策略在欧洲吸烟者队列研究和吸烟者病例-对照研究中均发现了该区域与遗传变异与吸烟成瘾有关，提示人群吸烟行为也存在遗传易感性18,19。因160165170175180185此，nAChRs 基因簇区域与肺癌的关联或是通过吸烟倾向介导，或是遗传变异对肺癌的发病有直接作用，或是遗传变异对吸烟行为和肺癌的发生都有直接的作用，目前的研究结果尚不一致，还有待进一步的研究。值得关注的是，约 15%的男

26、性肺癌患者和 53%的女性肺癌患者(约占肺癌总数的 25%)并没有吸烟史。研究表明，非吸烟者肺癌和吸烟者肺癌在病理、临床特征和肺癌的进展上均有明显的不同，认为它们可能是两种不同的疾病20。2010 年 4 月，Li 等在欧美非吸烟者中开展了肺癌 GWAS 研究。首先对 754 个非吸烟者(377 例肺癌病例和 377 例对照)331,918 个SNP 进行了检测，对信号最强的 SNP 在三个独立的非吸烟人群中进了验证，发现 rs2352028可显著增加肺癌的发病风险(OR=1.46，P=5.94106)。rs2352028 位于染色体 13q31.31 区域，进一步的 cis-eQTL 分析显

27、示，rs2352028 可显著影响 GPC5 基因的表达，其危险等位基因使得正常肺组织 GPC5 转录水平是肺腺癌组织的两倍(P=6.7510-11)20。GPC5 是磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖基因家族的一个成员，通过糖基磷脂(GPI)锚定在细胞浆膜上，并与许多蛋白质相互作用(包括生长因子、趋化因子和细胞外基质结构蛋白)，影响细胞的生长和分化，在肺癌的发生发展中起重要作用。2010 年 8 月，本课题组参与的亚洲非吸烟女性肺腺癌 GWAS 研究发表，该研究首先对584 例病例和 585 例对照的 457,504 个 SNP 进行了检测，并在 1,164 例病例和 1,736 例对照中进行了验证，发

28、现位于染色体 5p15.33 区域 CLPTM1L-TERT 上的 rs2736100 与非吸烟女性肺腺癌的发生存在显著关联(P=2.601020)21。该结果在其他非吸烟人群中同样得到了的验证22。2011 年 8 月，Ahn 等在韩国人群中进行了非吸烟者的肺癌 GWAS 研究，首先利用Affymetrix6.0 芯片检测了 446 例病例和 497 例对照，并在 434 例病例和 1,000 例对照中进行了验证，发现位于染色体 18p11.22 区域 FAM38B 基因内含子区的 2 个 SNP rs11080466 和rs11663246 与肺癌易感性有关，P 值分别为 1.0810-6

29、 和 2.3210-623。FAM38B 基因在多种组织中均有表达，在触觉和痛觉中发挥作用并引起力传导的广泛作用24。这些新研究结果有助于解释非吸烟者罹患肺癌的原因，但仍需要进行更多研究来解释这些基因变异如何与肺癌风险产生联系。2.1.3不同组织学病理类型肺癌肺癌按组织学病理类型可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者又包括腺癌、鳞癌和其他较为罕见的亚类。不同组织学病理类型的肺癌在遗传易感性上既有共性又有特殊性。例如，尽管吸烟对不同病理类型的肺癌均呈现剂量-反应效应，但对鳞癌的效应要强于腺癌25。而190且鳞癌和腺癌的发病机理、生物学特征及治疗方法等都有着本质的区别，在临床上鳞癌和腺-5-癌已被看

30、做是两种不同类型的疾病。因此，针对独特病理类型的肺癌进行研究，对肺癌的防治同样有着重要的意义。2009 年 11 月，Landi 等对来自于 13,300 肺癌病例和 19,666 例对照的全基因组 515,922个 SNP 的基因分型数据中有详细病理分型的样本进行了分析，发现染色体 5p15.33 区域 SNP195200205rs2736100 可显著增加肺腺癌的发病风险(OR=1.23，P=3.0210-7)，但未发现该位点与其他病理类型的肺癌易感性有关26。此位点在我们参与的亚洲非吸烟女性肺腺癌的 GWAS 中得到了验证21。2010 年 9 月，Miki 等发表了第一篇亚洲人群(日本

31、和韩国)的肺腺癌 GWAS 研究论文。该研究在日本人群(包括 1,004 例肺腺癌病例和 1,900 例对照)中进行了全基因组芯片扫描，并选择 P1.010-4 的 SNP 在 525 例肺腺癌病例和 7,678 例对照(日本人群)中进行第一阶段验证，对阳性关联 SNP(P0.05)在 569 例肺腺癌病例和 1,470 例对照(韩国人群)中进行第二阶段验证。结果发现染色体 3q28 区域(TP63 基因)的遗传变异 rs10937405 和 rs4488809 与肺腺癌存在显著关联27。GWAS 提供了特定组织学病理类型肺癌发病风险的敏感性证据，阐明了遗传对不同组织学病理亚型的肺癌的作用异同

32、，对建立早期发现和预防肺癌的有效测量指标具有重要意义。表 1. 肺癌 GWAS 发现的易感区域/位点Tab.1 Susceptibility Regions Identified by GWAS基因CHRNA3CHRNA3TERTCLPTM1LBAT3C3orf21MIPEP-TNFRSF19HORMAD2-LIFMTMR3-HORMAD2TP63TP63TERTGPC5CHRNA3FAM38BFAM38B染色体15q2515q255p155p156p213q2913q2222q1222q123q283q285p1513q3115q2518p1118p11位点rs8034191rs804237

33、4rs2736100rs402710rs3117582rs2131877rs753955rs17728461rs36600rs10937405rs4488809rs2736100rs2352028rs1051730rs11080466rs11663246人群特征欧美人群、肺癌欧美人群、肺癌欧美人群、肺癌欧美人群、肺癌欧美人群、肺癌韩国人群、肺癌中国人群、肺癌中国人群、肺癌中国人群、肺癌日本/韩国人群、肺腺癌日本/韩国人群、肺腺癌亚洲人群、肺腺癌、非吸烟者、女性欧美人群、肺癌、非吸烟者欧美人群、肺癌、吸烟者韩国人群、肺癌、非吸烟者韩国人群、肺癌、非吸烟者参考文献15775151616162727

34、21202、32323-6-3 结论210215220225230235240245250255GWAS 为肺癌的病因学研究提供了非常有价值的线索，目前已发现了 15q25、5p15.33和 6p21.33 等肺癌易感区域，且研究结果能够得到同类或后续研究验证和重复，已经被认为是目前肺癌易感基因筛选的最佳途径。GWAS 成功的原因主要体现在以下几个方面：(1)GWAS 一般基于大样本量的病例对照研究(上千对甚至上万对病例对照)进行筛选28，这些研究统计把握度较高，有能力发现真正的关联，这是 GWAS 检出肿瘤易感位点的关键，基于GWAS 的 meta 分析也证明增加样本量可以更有效的发现易感位

35、点29；(2) GWAS 采用更严格统计学检验水准(一般在 10-7 以下)大大降低了假阳性概率，提高了研究结果的真实性，有效解决了关联研究结果重现性差的问题；(3)多阶段多中心的独立验证策略在节约研究成本的同时增加研究结果的可靠性，是限制假阳性结果最有效的手段；(4) 成熟的基因分型技术和严格的质量控制(包括 DNA 样本、基因分型和统计分析等各个阶段)是基因组关联研究成功的基础保障。GWAS 在肺癌等恶性肿瘤遗传易感性研究方面取得了前所未有的成功，在未来几年中研究成果肯定会得到进一步的充实壮大，这些结果对于我们了解肿瘤的易感机制、探讨肿瘤的发病机制以及有针对性的开展高危人群遗传筛查、制定干

36、预措施甚至是指导肿瘤的治疗、预测患者预后等都具有重大意义。但是，我们应该清醒的认识到，现有 GWAS 的发现仅仅是冰山一角，还有更多遗传易感位点/区域有待发掘，我们在生物学机制研究以及临床转化等方面也同样面临着巨大的挑战。希望与荆棘并存，机遇与挑战同行，我们坚信沿着正确的道路走下去，必将破除肿瘤防治的坚冰，造福人类。参考文献 (References)1 Hung RJ, McKay JD, Gaborieau V, Boffetta P, Hashibe M, Zaridze D, et al., A susceptibility locus for lungcancer maps to ni

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