外伤性视神经损伤动物模型的建立及F_VEP评价

1、外伤性视神经损伤动物模型的建立及F_VEP评价    摘要目的建立视神经损伤和视神经损伤复合晶状体损伤动物模型,了解2种模型损伤后不同时间闪光视觉诱发电位(F-VEP)的变化规律。方法应用液压冲击颅脑损伤仪(FPI)建立兔外伤性视神经损伤模型和视神经损伤复合晶状体损伤模型。于损伤前及损伤后1、2、4、7、10、14、21、28 d行F-VEP检查并进行比较,并于上述各时间点制作视网膜切片,采用免疫组织化学法检测视网膜中巨噬细胞的数量,用焦油紫染色标记存活的视网膜神经节细胞(RGCs),对存活的RGCs进行计数。结果损伤后1 d,实验组与对照组的P100波

2、隐含值和振幅降低,与损伤前相比差异均有统计学意义(P<0·05)。损伤后实验组P100波隐含值延长的时间与对照组相比持续的时间短(P<0·05), 14 d后实验组比对照组P100波隐含值恢复得更快(P<0·05)。实验组随着损伤时间的延长巨噬细胞数量明显增加(P<0·05),而RGCs存活数逐渐减少(P<0·05),至损伤后28 d有所恢复。对照组表现出相同的变化趋势。结论应用FPI可以成功建立外伤性视神经损伤动物模型。视网膜组织病理学检测结果印证了F-VEP的检查结果。关键词视神经损伤;视网膜;晶状体;视觉诱发

3、电位;视功能外伤性视神经损伤是严重的致盲性疾病,对其治疗及损伤修复机制等方面的研究均基于合适的视神经损伤动物模型的建立1。由于损伤模型建立方法的不同,动物损伤后的视觉电生理结果也各不相同。视觉诱发电位(visualevoke potentia,l VEP)是检测外伤性视神经损伤一种客观而敏感的电生理指标,对外伤性视神经损伤的评价有重要价值2。闪光视觉诱发电位(flashVEP,F-VEP)波形稳定,重复性好,且无性别或眼别的差异3。本研究应用液压冲击颅脑损伤仪(fluid percussion brain injury device,FPI)建立一种稳定的兔视神经损伤模型以及视神经损伤复合晶状

4、体损伤模型,研究2种模型在损伤后不同时期F-VEP的变化规律,为进一步研究视神经损伤的修复机制奠定基础1材料与方法1.1实验动物及分组SPF级健康成年白兔64只,雌雄各半(天津医科大学实验动物中心提供),体重22·5 kg。分为实验组和对照组,每只兔的右眼为实验组(视神经损伤+晶状体损伤),左眼为对照组(视神经损伤)。再依据损伤后1、2、4、7、10、14、21、28 d各观察时间点按随机数字表法随机分为8个亚组,每组8只眼。1.2方法1.2.1视神经损伤动物模型的制作体积分数10%水合氯醛4mL/kg麻醉动物,点4%倍诺喜滴眼液表面麻醉。沿10: 002: 00方位弧形剪开双眼穹隆

5、部结膜。然后沿巩膜外壁将自制的打击管经结膜切口伸入眼眶内约1·5 cm,同时将白兔头部固定在FPI架上打击力量设定为(699·1±70·9)kPa。实验组视神经损伤后,以斜视钩牵拉上直肌暴露眼球后部,用半寸针灸针从眼球赤道部垂直刺入巩膜56mm,损伤晶状体赤道部,对照组仅进行视神经损伤。损伤后用妥布霉素滴眼液点双眼,每日3次,预防感染。1.2.2F-VEP记录方法及刺激参数参照国际临床视觉电生理标准,使用美国Nicolet多功能电生理诊断仪检测。体积分数10%水合氯醛4mL/kg麻醉动物,采用银针电极(阻抗<15 k)检测。记录电极在枕骨隆凸上3m

6、m,参考电极在双眼连线中点,地电极置于同侧耳廓4。采用LED眼罩闪烁刺激,刺激频率1·9Hz,通频带宽5100Hz,波宽0·2 ms,分析时间200ms,叠加70次,放大20倍。每只眼连续测量至少3次,每次间隔10min。检测1只眼时,对侧眼用不透光黑布完全遮盖。每只眼记录稳定波形3次。记录只兔损伤前的F-VEP,建立兔F-VEP隐含值和振幅的正常测量值范围。分别记录损伤后1、2、4、7、10、1421、28 d兔双眼F-VEP波的隐含值和振幅。1.2.3组织病理学检测分别取术后1、2、4、7、1421、28 d的视网膜、视神经组织切片进行免疫组织化学染色,用ED-1抗体标

7、记巨噬细胞,然后对巨噬细胞进行计数;另取同样的组织切片进行焦油紫染色标记存活的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs),进行计数。每隔24张切片取1张,共4张,要求以正好切到视盘的切面为中轴,前后各取2张。每张切片高倍镜下随机读取10个视野的巨噬细胞数或存活的RGCs数并计算其总和,每个标本记录4张切片细胞数总和的平均数,分析实验组与对照组不同时间点各亚组双眼视网膜相应细胞数量的变化规律。1.3统计学方法采用SPSS 13. 0统计学软件进行统计学处理。实验测试指标的数据资料以x±s表示,实验组、对照组损伤前后不同时间点以及各组间F-VEP波隐含值和

8、振幅变化的比较进行两因素方差分析,各时间点间和各组间的多重比较采用SNK-q检验。P<0·05为差异有统计学意义。2结果2.1F-VEP结果损伤前78·6%的白兔可引出典型的NPN波形,隐含值和振幅分别为(42·59±5·14)ms和(8·72±3·32)V(图1)。实验组损伤后1 d P100波隐含值为(103·59±11·36)ms,振幅为(6·58±3·39)V,与损伤前的隐含值和振幅相比差异均有统计学意义(P<0·05)。损伤

9、后1 d与损伤后10 d、损伤后10 d与损伤后28 d隐含值的差异均有统计学意义(P<0·05);损伤后10 d内隐含值逐渐延长(P<0·05),之后逐渐缩短(P<0·05)。损伤后1 d与损伤后7 d、损伤后7 d与损伤后28 d振幅的差异均有统计学意义(P<0·05),各相邻检测时间点间振幅差异无统计学意义(P>0·05)。振幅在损伤后7 d内逐渐降低(P<0·05), 7 d后逐渐升高(P<0·05)(图2)。对照组损伤后1 d P100波隐含值为(105·53&#

10、177;16·59)ms,振幅为(6·32±2·12)V,与损伤前的隐含值和振幅相比差异均有统计学意义(P<0·05)。损伤后1 d与损伤后14 d、损伤后14 d与损伤后28 d隐含值的差异均有统计学意义(P<0·05)。损伤后1 d与损伤后10 d振幅差异有统计学意义(P<0·05),损伤后10 d与损伤后28 d振幅差异无统计学意义(P>0·05),各相邻时间点间振幅差异无统计学意义(P>0·05)。损伤后14 d内隐含值逐渐延长(P<0·05),14

11、d后有缩短趋势(P<0·05);振幅在损伤后10 d内逐渐降低(P<0·05), 10 d后有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0·05)(图3)。实验组与对照组间损伤后21 d、损伤后28 d隐含值的差异有统计学意义(P<0·05),损伤后28 d振幅差异有统计学意义(P<0·05)。实验组隐含值的恢复快于对照组(P<0·05),损伤后14 d实验组较对照组隐含值恢复得更快,更接近损伤前水平;损伤后28 d实验组与对照组的振幅比较差异有统计学意义(P<0·05)(表1)。2.2组织

12、病理学结果实验组损伤后421 d各亚组间巨噬细胞计数差异有统计学意义(P<0·05)。损伤后228 d各亚组间存活的RGCs数量差异有统计学意义(P<0·05)。损伤后421 d,实验组与对照组的巨噬细胞数量差异有统计学意义(P<0·05)。损伤后110 d,实验组与对照组存活的RGCs数量差异无统计学意义(P>0·05)(表2)。2.2.1ED-1抗体标记巨噬细胞计数实验组巨噬细对照组巨噬细胞计数:损伤后4 d与损伤后7 d差异有统计学意义(P<0·05),损伤后4 d与损伤后10 d、4 d与14 d、7 d与

13、10 d、7 d与14 d、7 d与21 d、10 d与14 d、10 d与21 d、14 d与21 d差异均有统计学意义(P<0·05)。实验组与对照组视网膜均在损伤后4 d开始出现巨噬细胞,之后逐渐增多,损伤后10 d达到高峰,之后逐渐减少, 28 d后消失;但实验组各亚组巨噬细胞数量明显多于对照组(P<0·05)(图4,表2)。2.2.2焦油紫法检测存活的RGCs实验组存活的RGCs数量:损伤后1 d与损伤后7 d差异有统计学意义(P<0·05),损伤后1 d与损伤后10 d、1 d与14 d1 d与21 d、2 d与7 d、2 d与10

14、d、2 d与14 d、2 d与21 d、4 d与10 d、4 d与14 d、7 d与10 d、7 d与28 d、10 d与14 d、10 d与21 d、10 d与28 d、14 d与28 d、21 d与28 d,差异均有统计学意义(P<0·05)。实验组从损伤后1 dRGCs数量开始逐渐减少,损伤后10 d达到最低(图5), 10 d后RGCs数量逐渐回升(P<0·05),28 d后数量已恢复至损伤后2 4 d的水平(P>0·05)。对照组存活的RGCs数量:损伤后1 d与损伤后4 d差异有统计学意义(P<0·05),损伤后1 d

15、与损伤后7 d、1 d与10 d、1 d与14 d、1 d与21 d、1 d与28 d、2 d与7 d、2 d与10 d、2 d与14 d、2 d与21 d、2 d与28 d、4 d与7 d、4 d与10 d、4 d与14 d、4 d与21 d、4 d与28 d、7 d与10 d、7 d与14 d、7 d与21 d、7 d与28 d、10 d与14 d、14 d与28 d差异均有统计学意义(P<0·05)。对照组损伤后1 d存活RGCs数量开始逐渐减少,损伤后14 d达到最低, 14 d后RGCs数量逐渐回升(P<0·05), 28 d后已恢复至损伤后10 d的

16、水平(P>0·05)(表2)。3讨论外伤性视神经损伤是眼科常见病,发病率为0·3% 5·2%,近年来发病率有增高的趋势,预后不良, 40% 50%的患者可导致永久性失明5,目前对于视神经损伤尚无较好的治疗方法。有关外伤性视神经损伤的治疗及损伤修复机制等方面的研究均基于合适的视神经损伤动物模型的建立1。实验研究应采用具有临床模拟性、稳定性、可重复性、易操作性、可量化性等特点6的动物模型。以往的视神经损伤动物模型大体分为两类:一类是通过模拟临床闭合性颅脑外伤,建立间接性视神经损伤动物模型。但是由于间接性视神经损伤的发病机制复杂,人与其他动物解剖结构的差异,这种模

17、型不仅不能完全模拟临床上的间接性视神经损伤,而且成功率低、稳定性差、不容易量化。另一类是通过各种方法暴露视神经,然后用切割横断、挤压、牵引以及冷冻等方法造成视神经的直接损伤。这种模型可直视视神经损伤部位,可控性较强,损伤性质可以具体化,容易量化,是目前视神经损伤研究中所采用的主要动物模型,但是这种损伤模型临床模拟性较差7-8。本研究应用FPI建立外伤性视神经损伤动物模型,该模型具有临床模拟性好、稳定、可重复、易操作、可量化等优点9-10。目前国内外尚无应用其建立兔视神经损伤模型的报道。其损伤的机制为: FPI的打击锤从预定的角度落下,打击液压柱的橡皮活塞,挤压管内液体,形成液压冲击力,经上睑结

18、膜切口,作用于兔视神经,使视神经直接受到外力冲击的影响和挤压作用,同时眶内血管破裂引起视神经缺血,建立原发性视神经损伤模型。打击锤从不同的高度落下,产生不同的打击力量,通过压力传感器显示的波形可精确地反映损伤部位所受力量的大小,因而可以精确地制作不同程度的视神经损伤模型。可见, FPI制作视神经损伤模型的优点在于很接近临床状态的间接视神经损伤,损伤视神经的同时保持了其完整性,伤情稳定,重复性好,对操作者的依赖程度较小,且可大致定量致伤程度。致伤设备简单,操作简便;对于实验动物创伤较小,手术层次清晰,死亡率较低,利于术后继续饲养观察;与钳夹伤相比,致伤率稍低,避免过于强调接近临床状态而浪费实验动

19、物资源,但还应注意的是由于切口离视神经的距离较近,伤口一旦感染将会迅速影响到视神经。VEP是大脑皮层对视觉刺激产生的一簇电信号。F-VEP可用于视网膜至视皮层传导的评估,是评价视神经损伤的一种重要手段11。本研究通过对损伤前后兔F-VEP的检测,观察到使用FPI造成视神经损伤后F-VEP主波隐含值较损伤前延长、振幅降低,这与临床上视神经外伤后电生理的变化特征相符。说明使用FPI能够成功建立外伤性视神经损伤的动物模型。本研究经过多次预实验后选取(699·1±70·9)kPa的力量来模拟视神经损伤,经观察发现损伤后的兔行为方式无异常,说明脑组织功能正常。表明研究中选择

20、的冲击力不会引起脑组织损伤,但可成功损伤视神经,且实验组与对照组损伤后F-VEP P100波隐含值变化差异有统计学意义(P<0·05),说明该力量可以用于兔外伤性视神经损伤模型的制作。本研究中损伤后1 d实验组与对照组P100波隐含值的延长和振幅的降低与损伤前相比差异均有统计学意义(P<0·05)。VEP隐含值反映视神经髓鞘的传导功能,而振幅反映轴索的传导功能12。说明打击不仅造成了视神经髓鞘的损伤同时也造成了轴突的损伤。而观察视神经损伤后的变化过程,可以发现损伤后VEP的变化趋势并非一成不变,许多研究者认为视神经不完全损伤过程事实上是视神经原发性、继发性损伤与

21、自我修复之间的一种平衡过程13-14。通过实验组与对照组VEP结果的比较发现,损伤后早期实验组与对照组视神经的功能均逐渐下降,随着时间的延长, 2组视神经的功能均有不同程度的恢复,但实验组较对照组恢复得快且幅度较大,说明晶状体损伤对视神经的修复有促进作用。Leon等15将晶状体损伤对视神经修复的促进作用归功于单核/巨噬细胞浸润。这可能与损伤早期实验组活化的单核/巨噬细胞发挥以下几方面的作用有关: (1)吞噬作用,能清除抑制轴突再生的物质,如髓鞘碎片、胶质瘢痕等。(2)载脂蛋白E,参加脂类代谢并参与膜的重建。(3)直接或诱导神经胶质细胞分泌生长因子与细胞因子16,从而在损伤后期促进视神经轴突的再生。这也是视功能趋于稳定并有恢复趋势的主要原因