选修三基因工程基本操作步骤

1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 原核细胞的基因结构原核细胞基因原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的编码区下游的DNA序列，虽不序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等序列，如启动子、终止子等原核细胞的基因结构 RNA聚合酶的作用是催化聚合酶的作用是催化DNA转录为转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合

2、位点，并与其结合。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，转录开始后，RNA聚合酶沿聚合酶沿DNA分子移动，并分子移动，并与与DNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNA。真核细胞的基因结构与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是： 编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。为一种断裂的形式。 其中，能够编码蛋白质的序列叫做其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子

3、外显子，一般不，一般不能够编码蛋白质的序列叫做能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子。真核细胞的基因结构真核细胞基因真核细胞基因编码区编码区（间隔、不连续）（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质外显子：能编码蛋白质的的DNA序列序列内含子：不能编码蛋白内含子：不能编码蛋白质的质的DNA序列序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子动子、终止子原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是连续的连续的编码区是间隔编码区是间隔的、不连续的的、不连续的相同点相同点都由都由能够编码蛋白质的编能够编码蛋白质的编码区和

4、具有调控作用的非码区和具有调控作用的非编码区组成的编码区组成的基因的种类（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。调节基因。（2）没有转译产物的基因：如）没有转译产物的基因：如rRNA基因基因和和tRNA基因。基因。（3）不能转录的）不能转录的DNA片段：如操纵基因。片段：如操纵基因。启动子与终止子 启动子是在非编码区内紧靠转录起点，启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。使转录从起点

5、开始，沿编码区进行。 终止子是在非编码区内紧靠转录终点，终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。模板链上脱离下来，使转录终止。基因工程的基本操作流程基因组文库和部分基因文库基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库基因组文库和部分基因文库cDNA合成过程 n第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互互补的补的DNA单链，形成单链，形成RNA-DNA杂交分子。杂交分子。n第二步，核酸酶第二步，

6、核酸酶H使使RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的链降解，使之变成单链的DNA。n第三步，以单链第三步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下合成另一条互补的下合成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。 利用PCR技术扩增目的基因原理原理:DNA双链复制双链复制前提前提:要有一段已知要有一段已知目的基因的脱目的基因的脱氧核苷酸序列，氧核苷酸序列，以便合成引物。以便合成引物。获取目的基因n从基因文库中获取从基因文库中获取n利用利用PCR技术扩增技术扩增n利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成构建表达载体表达载体的组成表

7、达载体的组成1.目的基因目的基因2.启动子启动子3.终止子终止子4.标记基因标记基因基因工程载体的构建需要考虑哪些因素 （1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态

8、下的活性，中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗

9、生素基因，以便选择出真）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。正的转基因生物。 将目的基因导入受体细胞（植物细胞）农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法将目的基因导入受体细胞（动物细胞）n显微注射法显微注射法将目的基因导入受体细胞（微生物细胞）nCa2+处理处理目的基因的检测与鉴定n检测检测:n是否插入目的基因是否插入目的基因n是否转录是否转录n是否翻译是否翻译n鉴定鉴定:n功能活性鉴定功能活性鉴定n抗性鉴定抗性鉴定分别提取什么进行检测归纳步骤归纳: 基因工程的基本操作程序1.1. 获取目的基因获取目的基因u 从基因文库从基因文库u 利用利用PCRPCRu 化学方法人工合成化学方法人工合成2.2. 构建基因表达载体构建基因表达载体u 目的基因、启动子、终止子、