丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达

1、    丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达        【 摘要 】目的从感染HCV的中国患者血清中扩增编码HCV丝氨酸蛋白酶的cDNA，在大肠杆菌中进行表达。 方法从血清中提取HCV RNA，应用RT-PCR方法扩增HCV丝氨酸蛋白酶cDNA, Sanger双脱氧链终止法测定其序列，与pBV220载体构建重组质粒，在大肠杆菌中表达，SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白。 结果用RT-PCR方法扩增得到了HCV丝氨酸蛋白酶基因，序列分析表明其读码框架

2、正确，丝氨酸蛋白酶活性中心高度保守，同源性比较表明该区段来源于HCV/1b中国株，构建重组载体后，在大肠杆菌中获得了丝氨酸蛋白酶的表达。 结论HCV/1b型中国株丝氨酸蛋白酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的成功表达，为进一步研究该蛋白酶活性及影响因素打下了基础。【 主题词 】丙型肝炎病毒； 丝氨酸蛋白酶； 基因表达 Cloning and expression of hepatitis C virus serine protease geneFAN Tao, CHENG Jilin, LIANG Qinghua, et al.【 Abstract 】ObjectiveTo amplify and

3、clone the HCV cDNA fragment that encode serine protease from the serum of a Chinese patient infected with HCV and express it in E.coli. MethodsThe HCV RNA was extracted from serum, the cDNA that encode HCV serine protease was amplified by RT-PCR. Its sequence was determined by dideoxy-chain terminat

4、ion method. It was subcloned into vector pBV220 and expressed in E.coli. The expressed recombinant protein was analysed by SDS-PAGE electrophoresis and Western blot. ResultsThe HCV serine cDNA was cloned. Sequence analysis showed that its reading frame is correct and no insert or deletion mutation h

5、appened. Homology comparison suggested it is from a HCV type/1b isolate. This cDNA fragment was efficiently expressed in E.coli. ConclusionThe serine protease cDNA was amplified successfully from the serum of a Chinese patient with HCV(/1b) infection. The expression of the serine protease in E.coli

6、rollouted a basis for the study of its activity.【 Subject words 】Hepatitis C virus; Serine protease; Gene expression HCV为单股正链RNA病毒，其基因组长约9.5kb，编码区含一个大开放读码框架，编码3 0103 033个氨基酸残基的多蛋白前体，经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶加工成具有生物学功能的成熟蛋白。研究表明，HCV非结构蛋白NS3/NS4A，NS4A/NS4B，NS4B/NS5A，NS5A/NS5B位点的裂解由病毒编码的丝氨酸蛋白酶介导，该酶位于NS3区N端1,2。本研究中我

7、们应用RT-PCR方法，从感染HCV的患者血清中扩增了编码丝氨酸蛋白酶的cDNA，测定其核苷酸序列，构建表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。材料和方法血清标本来源：HCV患者血清来自本院门诊。工具酶和试剂：AMV-RT酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、Klenow大片段和限制性内切酶EcoR和Xba等均为Promega公司产品。RNasin为华美公司产品。菌种和质粒：大肠杆菌DH5为本所保存，pBV220质粒由预防医学科学院病毒研究所张智清教授构建并惠赠。pcDNA3为Invitrogen公司产品。PCR引物设计：参考HCV-J序列3，经Oligo5.0软件辅助设计，合成内、外两组引物，在内引

8、物对的5端和3端分别引入EcoR和Xba酶切位点及起始密码子和终止密码子。引物由CyberSyn 公司合成。引物序列为：外引物1R（4 1184 135）：GACATATACGCTCCAAAG；1F（3 3153 334）：ATCATCTCGGGTCTACCAGT；内引物2R（4 0914 106）：GACTCTAGATTAGTTTAGGACGAGCACC；2F（3 3723 387）：CAGGAATTCATGGCCGATAGTTTTGGAG。RT-PCR扩增目的基因：HCV RNA的提取参考文献4制备好的RNA于70变性5 min，再加入逆转录反应液，10l反应体系中，含1×AMV

9、-RT逆转录酶缓冲液，外引物1R 50pmol，dNTP终浓度各为200mol/L，AMV-RT酶0.5l，RNasin 10U，于421 h后，95 20 min。在逆转录产物中加入一次PCR反应液，50l反应体系中镁离子终浓度为1.5mmol/L，dNTP终浓度各为200mol/L，Taq-P为1.5U，引物1F 50pmol。第二次PCR仍为50l反应体系，取第一次PCR产物5l，内引物2R和2F各为50pmol，余同第一次PCR。PCR循环条件为94变性60 s，55退火90 s，72延伸120 s，35个循环。用6的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。重组表达质粒的构建：先将扩增的目的基

10、因克隆至pcDNA3质粒的EcoR/Xba之间，测定其序列，然后亚克隆至M13mp18载体，用EcoR/Sal酶切后，亚克隆至pBV220相应的位点。转化DH5感受态细胞。用含Amp的固体培养基（LA）筛选阳性克隆，小量提取质粒，酶切鉴定，构建重组表达载体pBV220-NS3S。具体重组技术参考文献5有关章节。核苷酸序列测定：采用Sanger双脱氧链终止法，以SP6和T7通用引物进行双向测序。目的蛋白的诱导表达和鉴定：挑取含重组载体pBV220-NS3S的单个菌落置于LA液体培养基中，30培养过夜，次日加入等量预温的培养基，42培养4 h。离心收集菌体，重悬菌体，加入等量2×SDS-

11、PAGE缓冲液，100煮沸5 min。经SDS-PAGE后，Coomassie亮蓝染色，观察结果。Western blot鉴定：蛋白经电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜上，以5%脱脂奶粉封闭，HCV抗体阳性血清为一抗，将碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG酶标抗体为二抗，在NBT/BCIP显色系统显色。结果1.目的基因的扩增：经过RT-PCR扩增后，获得的扩增产物与预期大小一致，无非特异扩增条带。我们将该片段称为NS3S（见1）。2.序列分析：以SP6和T7通用引物对pcDNA3-NS3S中的目的基因片段进行双向测序，结果表明，该片段为HCV基因，序列阅读框架正确。该片段长723个碱基（不含起始密码子和

12、终止密码子），翻译成241个氨基酸。同源性分析表明属于HCV/1b 型，与HCV型其它序列：中国河北株，HC-C2，HCV-J的同源性分别为：核苷酸95.16%，91.56%，91.15%；氨基酸95.85%，94.19%，93.78%。其核苷酸序列见2，氨基酸序列见3。1RT-PCR法扩增HCV NS3S cDNAFig 1. HCV NS3S cDNA amplification by RT-PCRM: PCR marker；Lane 1: Amplified product of HCV NS3S cDNA；Lane 2: Negative control2NS3S核苷酸序列Fig 2.

13、 NS3S nucleotide sequence3NS3S氨基酸序列Fig 3.Amino acid sequence of NS3S3.表达质粒的构建和鉴定：将NS3S片段定向克隆至pBV220载体，转化DH5细胞后，在LA固体培养基上筛选抗性克隆，挑取阳性菌落经培养，提取质粒，用EcoR/Xba酶切鉴定，电泳后可见载体片段和目的基因片段均与预期大小一致，成功构建重组载体pBV220-NS3S（见4）。4.NS3S基因在E.coli中的表达：pBV220是一个含PLPR启动子的原核高效表达载体，它同时含有cI调控基因，多酶切位点和两个强的转录终止序列，带有起始密码子ATG的外源基因可以插入

14、启动子下游的多酶切位点，表达非融合蛋白6含重组载体的E.coli经温控诱导后，SDS-PAGE染色显示，表达了相对分子质量(Mr)约2.8×103的NS3S蛋白。Western blot结果显示，该蛋白条带为HCV特异蛋白。4重组载体pBV220-NS3S的鉴定Fig 4. Identification of recombinant vector pBV220-NS3SM1: DNA/Hind marker；Lane 1: pBV220 digested by EcoR；Lane 2: pBV220-NS3S digested by EcoR/Xba；M2: X174 DNA/Hae

15、 marker讨论HCV基因组具有很大的变异性，这可能是由于HCV复制酶缺乏校正功能，以及宿主的免疫选择压力共同作用所致。对HCV的序列和型别进行分析，有助于HCV的流行病学调查，研制诊断试剂，发展预防性疫苗，并且对临床治疗有重要的指导作用7。对HCV基因序列进行分析也有助于HCV的生物学功能研究。Yamaka K等8在对HCV蛋白酶活性进行研究时发现，来自同一患者血清的多个NS3 cDNA克隆中，有蛋白酶活性的克隆和无蛋白酶活性的克隆同时存在。对所有的克隆进行序列分析和比较表明，无蛋白酶活性的克隆其序列存在如下特点：(1) 氨基酸1079位无义突变，导致蛋白翻译过程的提前终止，病毒株表现为复

16、制缺损。(2) HDS催化中心His-1083点突变，直接导致蛋白酶活性缺失。(3) 某些位点的点突变可能与蛋白酶活性缺失有关，如Pro1168-Thr，Arg1135-Gly, 这些氨基酸似与维持NS3蛋白酶活性中心的构型有密切关系。本研究中我们应用RT-PCR方法，从HCV感染者血清中成功地扩增了HCV丝氨酸蛋白酶基因，克隆和序列分析结果显示，该片段来源于HCV/1b株。其阅读框架正确，无缺失或插入突变，未发生无义突变。丝氨酸蛋白酶催化中心三联体基序His-1083，Asp-1107，Ser-1165，及上述与蛋白酶活性密切相关的位点，在我们克隆的片段中均高度保守。我们将扩增的HCV丝氨酸

17、蛋白酶基因克隆至原核表达载体pBV220，经温控诱导后，在大肠杆菌中获得了高效表达。由于HCV基因组在翻译后前体蛋白的酶切加工是其基因表达的重要策略，通过酶切加工，前体蛋白裂解成有生物学活性的成熟蛋白9。因此，HCV蛋白酶与病毒基因组的复制表达，以至病毒的整个生命周期均有密切的关系。而且，HCV丝氨酸蛋白酶是抗HCV药物作用的重要的靶点之一，对丝氨酸蛋白酶的克隆和表达，有助于研制抗HCV药物10。我们对HCV蛋白酶基因的克隆和表达为这些领域的研究打下了基础。作者单位：范涛(北京医科大学人民医院肝病研究所，100044)程计林(北京医科大学人民医院肝病研究所，100044)梁庆华(北京医科大学人

18、民医院肝病研究所，100044)陶其敏(北京医科大学人民医院肝病研究所，100044)参考文献1，Major ME, Feinstone SM. The molecular virology of hepatitis. Hepatology, 1997, 25:1527-1538.2，Lin C, Pragai BM, Grakoui A, et al. Hepatitis C virus NS3 serine proteinase: trans-cleavage requirements and processing kinetics. J Virol, 1994, 68:8147-8157.3，Kato N, Hijikata M, Ootsuyama Y, et al. Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:9524-9528.4，杜绍财，陶其敏，孙焱，等. 双PCR检测丙型肝炎病毒RNA. 北京医科大学学报, 1991，23：429