分光光度法测定Fenton体系中产生的羟自由基

1、Determination of hydroxyl radical in Fenton reaction by spectrophotometryYANG Ming-hui,HE Li-xian,LI Zhen-gui(College of Life Science and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China Abstract A new photometric method was proposed for the determination of the hydroxyl free radical produced by F

2、enton reaction.The color intensity of neutral red (NR was changed before and after the oxidation reaction.The amount of hydroxyl radical produced in the system was indirectly determined through absorbance changed at a wavelength of 520nm (A 520by means of spectrophotom-etry.The optimal experimental

3、condition was studied and obtained.Under the selected conditions,good relationship was obtained be-tween the scavenging effects of the hydroxyl free radical and the concentration of mannitol and thiourea.The resistance to hydroxyl radical oxidation of six antioxidants such as ferulic,rutin was evalu

4、ated.The method can be applied for the selection of antioxidants and study of mechanism of hydroxyl radical.Key words hydroxyl radical;neutral red;fenton reaction;spectrophotometry随着自由基生物学与自由基医学研究的迅速发展,现已证明多种疾病的发生和发展与自由基对组织细胞的损伤关系密切,羟自由基是生物体内危害最大,活性最强的氧自由基1。人体在正常的生命活动中通过新陈代谢即可产生羟自由基,它可以通过电子转移、加成以及夺取

5、氢原子和羟基化等反应,造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤。因此,对羟自由基的研究在生命科学及环境科学等领域中引起了人们的广泛兴趣,而测定及筛选抗羟自由基物质是重要内容。目前,离体检测羟自由基的方法已有一些报道,其中利用DMPO 捕获羟自由基的电子顺磁共振(ESR 法2以及高效液相色谱法灵敏度较高,但所用仪器昂贵,一般实验室难以应用。光度测定法因具有仪器简单、操作方便、灵敏度高的特点,而得到广泛的应用46。Fenton 反应是经典的产生羟自由基的体系3,可认为能模拟人体内产生羟自由基的过程。而中性分光光度法测定Fenton 体系中产生的羟自由基杨明惠,何丽仙,李珍贵(大理学院

6、生命科学与化学学院,云南大理671003摘要Fenton 反应产生的羟自由基与中性红反应,颜色发生变化,用分光光度计测定其A 520值的变化,可间接测定羟自由基的生成量,通过对测定条件的研究,得到最佳实验条件。抗氧化药物甘露醇、硫脲与羟自由基清除率具有明显的量效关系。测定了阿魏酸、芦丁等几种中药活性成分清除羟自由基的功能,此法可用于羟自由基清除剂的筛选及抗羟自由基机理研究。关键词羟自由基;Fenton 反应;中性红;光度法中图分类号O657.3文献标识码A 文章编号1672-2345(200704-0038-03收稿日期2007-02-28作者简介杨明惠(1964-,女(白族,云南大理人,副教

7、授,主要从事分析化学及植物化学研究.大理学院学报JO U R N A L O F D A LIU N I V ER S I TY第6卷第4期2007年4月V ol .6N o.4A pr .200738红(NR 与羟自由基发生反应后,其吸光度A 520发生变化,当抗氧化剂加入到含OH 的溶液中时,可以和OH 结合,从而将其清除,这样吸光度A 520的变化减少。根据上述原理,本文建立了中性红与羟自由基反应的光度测定法,并成功用于测定中药活性成分对OH 的清除率。1实验部分1.1主要仪器与试剂722型光栅可见分光光度计(山东高密分析仪器总厂;pH S-2C 型精密酸度计(上海精科雷磁;CS501型

8、超级恒温器(上海浦东跃欣科学仪器厂。FeSO 4溶液:4.0mmol /L ,称取FeSO 47H 2O 晶体111.2mg ,用水溶解,定容于100ml 容量瓶中;0.02%(体积分数过氧化氢(当天配制;0.04mol /L B-R 缓冲溶液:称取硼酸(H 3BO 30.6233g ,冰乙酸(HAc 1.2ml ,磷酸(H 3PO 41.2ml ,用水稀释至250ml ;0.50mmol /L 中性红溶液(NR ;1.0mmol /L 甘露醇;1.0mmol /L 硫脲;2.0×10-3mmol /L 阿魏酸;2.0×10-3mmol /L 芦丁;2.0×10-

9、3mmol /L 槲皮素;2.0×10-3mmol /L 厚扑酚。所用试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水。1.2实验方法1.2.1测定原理Fenton 试剂是产生羟自由基的经典方法,其反应机理如下:Fe 2+H 2O 2Fe 3+OH+OH-所产生的羟自由基与中性红作用后,使其褪色,利用仪器所测到的吸光度变化间接测定所产生的羟自由基。加入H 2O 2前加入羟自由基清除剂,则Fenton 反应产生的羟自由基被清除或部分清除,体系在520nm 的吸光度降低程度相应减小。1.2.2羟自由基HO的测定在10ml 具塞比色管中,加入pH4.5缓冲溶液2.0ml ,0.50mmol /L 中性红1.

10、6ml ,4.0mmol /L FeSO 4溶液1.0ml ,0.02%过氧化氢1.4ml ,用水稀释至刻度,混匀,于室温反应10min ,以蒸馏水作参比,用1.0cm 比色皿在520nm 波长处,测定其吸光度A 1,另一份不加Fenton 试剂,测吸光度值A 0,计算A=A 0-A 1,羟自由基的生成量用A 值表示。1.2.3羟自由基清除率的测定按以上方法,加入抗氧化药后测其吸光度A 2,按下式计算羟自由基清除率s 为:s=(A 2-A 1/A 0-A 1×100%2结果与讨论2.1实验条件的选择2.1.1吸收光谱按实验方法,在722型光栅可见分光光度计上扫描,获得吸收光谱曲线,如

11、图1,曲线表明,最大吸收波长均在520nm 附近,此处A=A 0-A 1达最大值,故选择520nm 为测定波长。1:1.6mlNR+2.0ml B-R ;2:1.6mlNR+2.0ml B-R+1.0ml FeSO 4+1.4mlH 2O 2;图1吸收光谱Fig.1.Absorption spectra2.1.2酸度的影响按试剂手册配制不同系列pH值为411的缓冲溶液,并按本实验方法测量各个pH 点的吸光度A 520。实验结果表明,在pH4.5B-R 缓冲溶液下,A 520达最大值,故本实验选用pH4.5的B-R 缓冲溶液。同时考察了缓冲体系用量对褪色反应的影响。实验表明,加入1.0ml 10

12、.0ml 的pH4.5的B-R 缓冲溶液,吸光度先逐渐上升,在缓冲溶液用量为2.0ml 以上时,吸光度基本保持不变。本实验选用缓冲溶液用量为2.0ml 。2.1.3中性红用量的影响结果表明,随着0.50mmol /L中性红溶液(NR 用量的增大,A 520值增大,中性红用量为1.6ml 时,A 520值为最大。实验选用中性红用量为1.6ml 。2.1.4过氧化氢用量的影响其他条件不变,加入不同体积的0.02%过氧化氢溶液,随过氧化氢浓度的增加,A 520逐渐增加(图2,0.02%过氧化氢用量在1.41.8ml 之间,A 520值变化缓慢,故实验选用0.02%过氧化氢的用量为1.4ml 。杨明惠

13、,何丽仙,李珍贵分光光度法测定Fenton 体系中产生的羟自由基第6卷总第40期39图2A与H2O2,FeSO4的用量关系(体积 Fig.2.Effect of Dosage of H2O2,FeSO4on the Absorp-tion2.1.5FeSO4浓度的影响其他条件不变,加入不同体积的4.0mmol/L FeSO4溶液,随FeSO4浓度的增加,A520逐渐增加(图2,其体积达1.0ml后,A520值增加缓慢,故实验选用4.0mmol/L FeSO4的用量为1.0ml。2.1.6反应温度的影响按实验方法,分别在25、30、35、40、45、50、55下测定体系的A520。结果表明,随着

14、反应温度的增加,体系A520增加较慢,考虑到实验操作的方便性以及测量误差,实验选用室温作为反应温度。2.1.7反应时间的影响在上述选定的反应条件下,在60min以内,室温下反应10min后,A变化缓慢,可见本方法稳定性较好。实验选用反应10min作为反应时间。2.2抗氧化剂对羟自由基的清除作用依照实验方法,对甘露醇、硫脲等几种抗氧化剂对羟自由基的清除能力进行了分析,实验结果见图3。由图3可知,各抗氧化剂的羟自由基清除能力均与抗氧化剂用量成量效关系,当抗氧化剂用量增大时,羟自由基清除率也增加,但当其用量增大到一定程度后,表现抗羟自由基清除率(S增长平缓,即该抗氧化剂的药效渐趋饱和。结果表明,本体

15、系的建立对筛选清除OH的天然抗氧化剂,研究清除自由基的机理有一定的应用价值。注:1.2.0×10-3mmol/L芦丁;2.1.0mmol/L硫脲;3.2.0×10-3mmol/L阿魏酸;4.2.0×10-3mmol/L槲皮素;5.2.0×10-3mmol/L 厚扑酚;6.1.0mmol/L甘露醇。图3抗氧化剂与清除率的量效关系Fig.3.Relationship between concentration of antioxi-dants and scavenging percentage参考文献1方允中,郑荣梁.自由基生物学的理论与应用M.北京:科学出版社,2002.2Shao-An Cheng,Wai-Kit Fung,Kwong-Yu Chan,et al.Optimizing electron spin resonance detection of hydroxylradical in waterJ.Chemosphere,2003,(521797-1