第四章第二节植物体细胞无性系变异及突变体筛选

1、第二节第二节 植物体细胞无性系变异及突变体筛选植物体细胞无性系变异及突变体筛选 将植物外植体在组织培养过程中，由于受到非生将植物外植体在组织培养过程中，由于受到非生物因子的诱导发生变异，进而导致再生植株发生遗物因子的诱导发生变异，进而导致再生植株发生遗传变异的现象称为体细胞无性系变异（传变异的现象称为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。）。 植物体细胞无性系变异现象是植物组织培养中的植物体细胞无性系变异现象是植物组织培养中的普遍现象。并可产生有益变异性状，对品种改良具普遍现象。并可产生有益变异性状，对品种改良具有重要意义，已成为植物种质资源创新和品种选育有重要意义，已

2、成为植物种质资源创新和品种选育的有效途径。的有效途径。一、体细胞无性系变异的广泛性一、体细胞无性系变异的广泛性 体细胞无性系变异主要表现：体细胞无性系变异主要表现： (1) 植株外部形态变异，如株高、叶形、叶色等；植株外部形态变异，如株高、叶形、叶色等； (2) 育性上的变异；育性上的变异； (3) 生长势上的变异；生长势上的变异； (4) 抗性变异；抗性变异； (5) 某些酶及同工酶变化；某些酶及同工酶变化； (6) 次生代谢物的差异。次生代谢物的差异。二、植物体细胞无性系变异的来源二、植物体细胞无性系变异的来源源于外植体预先存在的变异源于外植体预先存在的变异 所用外植体体内存在变异细胞，由

3、变异细胞再生所用外植体体内存在变异细胞，由变异细胞再生的植株可能为变异植株。的植株可能为变异植株。2. 离体培养诱导的变异：离体培养诱导的变异： 植物组织培养本身对植物细胞产生一种胁迫作用，植物组织培养本身对植物细胞产生一种胁迫作用，从而诱发植物细胞发生可遗传变异和表观遗传变异从而诱发植物细胞发生可遗传变异和表观遗传变异（epigenetic variation）。表观遗传变异是指不是由）。表观遗传变异是指不是由DNA序列改变而引起的植株表型变异。序列改变而引起的植株表型变异。（1）培养基成分和培养条件：）培养基成分和培养条件： 植物激素和生长调节剂是诱导体细胞无性系变异的重要原因植物激素和生

4、长调节剂是诱导体细胞无性系变异的重要原因之一，培养基中含有多种激素时，其诱变率大于单一激素。之一，培养基中含有多种激素时，其诱变率大于单一激素。 生长素既能促进多倍体细胞分裂，又能诱导多倍体，尤其是生长素既能促进多倍体细胞分裂，又能诱导多倍体，尤其是2，4-D具有更强的诱变作用。具有更强的诱变作用。 此外，高温、低温等培养条件也能促进染色体变异。部分植物此外，高温、低温等培养条件也能促进染色体变异。部分植物细胞悬浮培养比固体培养易变异。细胞悬浮培养比固体培养易变异。（2）植株再生途径：）植株再生途径： 体细胞胚胎发生途径遗传稳定性优于器官发生途径，尤其是体细胞胚胎发生途径遗传稳定性优于器官发生

5、途径，尤其是经历脱分化形成愈伤组织的间接器官发生途径变异频率较高。经历脱分化形成愈伤组织的间接器官发生途径变异频率较高。 （3）培养时间和继代频率：）培养时间和继代频率： 继代培养时间越长，变异率越高。如香蕉茎尖繁殖经过继代培养时间越长，变异率越高。如香蕉茎尖繁殖经过5、7、9、11次继代培养，体细胞无性系变异率分别为次继代培养，体细胞无性系变异率分别为1.3%、1.3%、2.9%、3.8%。（4）母本植株的遗传状态：）母本植株的遗传状态： 不同物种再生植株变异率存在差异，同意物种不同品种不同物种再生植株变异率存在差异，同意物种不同品种无性系变异率也有差别，同一物种多倍体变异率高于二倍无性系变

6、异率也有差别，同一物种多倍体变异率高于二倍体。同一植株不同外植体变异率也存在差异。体。同一植株不同外植体变异率也存在差异。三、体细胞突变体的特征和类型：三、体细胞突变体的特征和类型：特征：特征：突变发生的频率较低；突变发生的频率较低；(2) 突变随机发生具有偶然性；突变随机发生具有偶然性；(3) 突变的表型在没有选择压力的条件下仍然突变的表型在没有选择压力的条件下仍然稳定；稳定；1. (4) 表现型应能通过有性传递保持其特性。表现型应能通过有性传递保持其特性。2. 体细胞突变体的类型：体细胞突变体的类型：（1）营养缺陷型：）营养缺陷型： EMS(甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯) 处理烟草悬浮细胞诱导

7、突处理烟草悬浮细胞诱导突变，通过加入变，通过加入BUdR（5-溴脱氧尿苷）进行筛选。溴脱氧尿苷）进行筛选。 已已 选择出需要生物素、次黄嘌呤、对氨基苯甲选择出需要生物素、次黄嘌呤、对氨基苯甲酸、赖氨酸、精氨酸及脯氨酸的六种营养缺陷型。酸、赖氨酸、精氨酸及脯氨酸的六种营养缺陷型。（2）抗性突变体：）抗性突变体： A. 抗氨基酸及类似物的突变体抗氨基酸及类似物的突变体 选择相应的氨基酸生产过量的抗性突变体，选择相应的氨基酸生产过量的抗性突变体，原理是关键酶对反馈抑制不敏感，超越常量的原理是关键酶对反馈抑制不敏感，超越常量的合成对应氨基酸，或能减少或拒绝摄入氨基酸合成对应氨基酸，或能减少或拒绝摄入氨

8、基酸或类似物，或能分解和转化而解毒。或类似物，或能分解和转化而解毒。B. 抗抗菌素药物突变体：抗抗菌素药物突变体： 抗链霉素、卡那霉素和氯霉素等突变体，抗链霉素、卡那霉素和氯霉素等突变体，多为细胞质遗传。多为细胞质遗传。 烟草细胞抗链霉素细胞系在（烟草细胞抗链霉素细胞系在（250-500ug/ml）的链霉素培养基上再生植株表现）的链霉素培养基上再生植株表现绿色。绿色。 C. 抗除草剂突变体：抗除草剂突变体： 培养在添加除草剂培养在添加除草剂Picloram（4-氨基氨基-3，5，6三氯吡啶羧酸）培养基上的烟草中，分离出三氯吡啶羧酸）培养基上的烟草中，分离出抗除草剂突变体。抗除草剂突变体。 这类

9、抗性属于单个显性或半显性突变遗传。这类抗性属于单个显性或半显性突变遗传。D. 抗病突变体：抗病突变体： 烟草单倍体细胞经烟草单倍体细胞经EMS处理后，培养在添处理后，培养在添加蛋氨酸磺基圬（病毒素类似物）的培养基上，加蛋氨酸磺基圬（病毒素类似物）的培养基上，由存活的细胞产生愈伤组织并分化成植株，对由存活的细胞产生愈伤组织并分化成植株，对病原体感染不敏感。病原体感染不敏感。E. 其他突变体：其他突变体： 抗核酸碱基类似物的突变体体；碳源利抗核酸碱基类似物的突变体体；碳源利用突变体；激素自养型突变体；温度敏感突用突变体；激素自养型突变体；温度敏感突变体；耐盐、耐早等环境胁迫的突变体等。变体；耐盐、

10、耐早等环境胁迫的突变体等。四、体细胞无性系变异的遗传学基础：四、体细胞无性系变异的遗传学基础： 体细胞无性系变异具有其遗传基础，表现在染色体结构和体细胞无性系变异具有其遗传基础，表现在染色体结构和数量的变异、基因突变、扩增、丢失、重排和转座子激活等。数量的变异、基因突变、扩增、丢失、重排和转座子激活等。染色体数目变异染色体数目变异 体细胞培养中产生的染色体数目变异主要源自有丝分裂过体细胞培养中产生的染色体数目变异主要源自有丝分裂过程中纺锤体的异常。在细胞分裂的后期，不同程度的纺锤体缺程中纺锤体的异常。在细胞分裂的后期，不同程度的纺锤体缺失导致染色体不分离、移向多级、滞后或不聚集，最终产生变失导

11、致染色体不分离、移向多级、滞后或不聚集，最终产生变异。异。（1）整倍体变异）整倍体变异 染色体自然加倍现象称为体细胞内染色体自然加倍现象称为体细胞内多倍化，可能是在有丝分裂过程中纺锤体合成受阻引起，多倍化，可能是在有丝分裂过程中纺锤体合成受阻引起，也可能是细胞质不分裂而形成多核细胞。也可能是细胞质不分裂而形成多核细胞。（2）非整倍体变异）非整倍体变异 非正倍体的出现多是由于多级纺非正倍体的出现多是由于多级纺锤体出现、染色体不分离或滞后以及核碎裂等导致。锤体出现、染色体不分离或滞后以及核碎裂等导致。2. 染色体结构变异染色体结构变异 包括染色体断裂后经过修复和重新连接形成的易位、包括染色体断裂后

12、经过修复和重新连接形成的易位、倒位、缺失和重复等结构变异。倒位、缺失和重复等结构变异。（3）基因突变）基因突变 包括核基因突变和细胞质基因突变。基因突包括核基因突变和细胞质基因突变。基因突变分为隐形单基因或多基因突变和显性单基因或多基因突变。变分为隐形单基因或多基因突变和显性单基因或多基因突变。（4）转座因子活化）转座因子活化 转座因子是指能在基因组中移动和修转座因子是指能在基因组中移动和修饰基因表达的饰基因表达的DNA序列。转座因子插入到新的基因位点引起邻序列。转座因子插入到新的基因位点引起邻近基因转录特性不稳定地抑制或修饰，转座作用可可以造成染近基因转录特性不稳定地抑制或修饰，转座作用可可

13、以造成染色体断裂、染色体缺失、重复、倒位和易位，而引起性状变异。色体断裂、染色体缺失、重复、倒位和易位，而引起性状变异。转座子激活也是体细胞无性系变异的主要原因之一。转座子激活也是体细胞无性系变异的主要原因之一。 (5) DNA甲基化甲基化 甲基化是指甲基化是指DNA复制后，在复制后，在DNA甲基化酶甲基化酶的催化下，将的催化下，将S-腺苷酰甲硫氨酸（腺苷酰甲硫氨酸（SAM）上的甲基转移到）上的甲基转移到DNA分子的胞嘧啶碱基上的分子的胞嘧啶碱基上的DNA修饰过程。当一些基因的某些位置修饰过程。当一些基因的某些位置甲基化后，其基因表现为不活跃的非表达基因；去甲基化后，甲基化后，其基因表现为不活

14、跃的非表达基因；去甲基化后，则活跃表达。组织培养诱发的突变直接或间接与则活跃表达。组织培养诱发的突变直接或间接与DNA甲基化状甲基化状态改变有关。态改变有关。五、体细胞突变体的诱发和筛选：五、体细胞突变体的诱发和筛选：1、材料的选择：、材料的选择： 选择原则：避免采用不能再生或难以再生的材选择原则：避免采用不能再生或难以再生的材料；要选用染色体稳定的细胞系进行起始诱导。料；要选用染色体稳定的细胞系进行起始诱导。要选择生长速度快的细胞。要选择生长速度快的细胞。2、细胞的来源：、细胞的来源： 愈伤组织、悬浮培养细胞和原愈伤组织、悬浮培养细胞和原生质体。生质体。（1）愈伤组织：）愈伤组织： 优点：取

15、材方便优点：取材方便 缺点：生长较悬浮细胞慢；缺点：生长较悬浮细胞慢；接触选择剂不均匀；聚集体较大，接触选择剂不均匀；聚集体较大，抗性细胞不易正常生长；物理或抗性细胞不易正常生长；物理或化学诱变作用不均一。化学诱变作用不均一。（2）悬浮细胞：）悬浮细胞： 广泛采用的材料；广泛采用的材料； 缺点是存在细胞聚集的现象影响诱变效果。缺点是存在细胞聚集的现象影响诱变效果。（3）原生质体：）原生质体： 是比较理想的诱变细胞来源。是比较理想的诱变细胞来源。 缺点是植株再生困难。缺点是植株再生困难。3、突变的诱发：、突变的诱发：（1）诱变因素：）诱变因素： 可以采用物理或化学的方法进行诱变处理。如，可以采用

16、物理或化学的方法进行诱变处理。如，如如EMS，NG(亚硝基胍亚硝基胍)，和，和r射线等。射线等。 但诱变剂并非必需，许多突变体的获得不需添加诱但诱变剂并非必需，许多突变体的获得不需添加诱变剂，如抗菌素突变体的获得无需加入诱变剂，直接变剂，如抗菌素突变体的获得无需加入诱变剂，直接利用选择剂进行筛选。利用选择剂进行筛选。物理诱变剂：物理诱变剂： 优点不需洗涤诱变剂，优点不需洗涤诱变剂， 缺点是需要特定的设备。缺点是需要特定的设备。UV是常用的诱变是常用的诱变因子；因子；射线等进行辐射处理诱变。射线等进行辐射处理诱变。化学诱变剂：诱变处理后需要去除。化学诱变剂：诱变处理后需要去除。 依据对依据对DN

17、A作用方式可分为三类：作用方式可分为三类： A. 与核酸碱基反应而且留在原位，从而引起与核酸碱基反应而且留在原位，从而引起DNA复复制时碱基配对的改变。如亚硝酸，硫酸二乙酯，制时碱基配对的改变。如亚硝酸，硫酸二乙酯，EMS，乙烯亚胺，亚硝基胍等；乙烯亚胺，亚硝基胍等； B. 天然碱基类似物，在核酸复制时，它们可掺入到天然碱基类似物，在核酸复制时，它们可掺入到新合成的新合成的DNA分子中。如分子中。如BUdR，8-氨基鸟嘌呤，氨基鸟嘌呤，2-氨基嘌呤等；氨基嘌呤等； C. 移码突变，如丫啶类物质等。移码突变，如丫啶类物质等。（2）诱变因子剂量与诱变方法选择：）诱变因子剂量与诱变方法选择： 诱变时

18、期、诱变剂量、剂量率影响诱变效果。诱变时期、诱变剂量、剂量率影响诱变效果。 诱变方法：较低剂量的诱变剂处理，或不同诱变方法：较低剂量的诱变剂处理，或不同剂量率的诱变剂处理，或采用复合诱变，两种剂量率的诱变剂处理，或采用复合诱变，两种诱变剂同时使用；一种诱变剂多次使用；两种诱变剂同时使用；一种诱变剂多次使用；两种诱变剂交替使用。诱变剂交替使用。 当诱变处理时，可在培养基中加入诱变剂。当诱变处理时，可在培养基中加入诱变剂。诱变处理后用大量稀释法或用解毒剂终止诱变诱变处理后用大量稀释法或用解毒剂终止诱变剂的作用。剂的作用。 诱变处理的另一种方法是，先在植株水平诱变处理的另一种方法是，先在植株水平上进

19、行诱变处理，再在组织培养中筛选如抗上进行诱变处理，再在组织培养中筛选如抗除草剂突变体的获得。除草剂突变体的获得。4、突变体的选择：、突变体的选择：（1）正选择法：）正选择法：直接选择法，突变细胞能直接选择法，突变细胞能够在有毒或有害培养基上生长。抗性突变体，够在有毒或有害培养基上生长。抗性突变体，激素自养型突变体等。激素自养型突变体等。（2）负选择法：）负选择法： 采用某一非允许条件的培养基，使突变体采用某一非允许条件的培养基，使突变体不能生长，而野生型能够生长，然后添加一不能生长，而野生型能够生长，然后添加一负选择剂，杀死生长细胞，而不能杀死不生负选择剂，杀死生长细胞，而不能杀死不生长的突变细胞，而保留下来受到选择。长的突变细胞，而保留下来受到选择。（3）