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1、尊敬的中国微生态学杂志编辑：“金黄色葡萄球菌的耐药性分析及基因分型研究”一文是由鲍宏达等撰写的论著。该文通过实验分析了上海某大型医院的院内分离菌株的耐药谱和基因型，并研究了菌株的亲缘关系，对防治强致病多耐药型金黄色葡萄球菌在该院的流行提出了有针对性的意见和建议。敬请各位编辑给予指正，谢谢！文章第一作者：鲍宏达，男，1987年生，研究方向：分子流行病学通讯作者：刘畅，Email: tiantianlc我们保证该文章从未在任何公开杂志发表，也绝对没有一稿多投。金黄色葡萄球菌的耐药性分析及基因分型研究鲍宏达 徐白莹 刘畅 韩立中 倪语星 郭晓奎（上海交通大学医学院 上海 200025） 摘要 目的

2、通过分析上海地区院内分离金黄色葡萄球菌的药敏谱型及对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）进行基因谱型的研究，了解金黄色葡萄球菌的院内流行状况。方法 对临床分离出的43株金黄色葡萄球菌进行药敏试验和SCCmec基因盒的多重PCR检测，并将结果整合后用MEGA3.1软件分析其进化相关关系。结果 药敏结果显示43株金葡菌对青霉素和甲氧西林的耐药率最高。甲氧西林的耐药率达到62.8。MecA阳性菌株SCCmec的分型显示均为II型或III型，且所占比例相近，未见I型和IV型。进化树分析发现了在同一医院中亲缘关系相近的菌株，为院内感染流行株。结论 MecA基因介导的MRSA在分离菌株中所占比例高，存在

3、院内感染爆发性流行。关键词 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、基因谱型、多重PCR、耐药性、院内感染Typing and phylogeny analysis of methcillin-resistant Staphylococcus aureus in nosocomial infections.Hong-da BAO，Bai-ying XU，Chang Liu，Li-zhong Han, Yu-xing Ni, Xiao-kui Guo(Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, 200025 China)Abstra

4、ct Objective To determine the antimicrobial susceptibility and molecular types among clinical isolates of Methcillin-resistant Staphylococcus aureus from different departments in Shanghai Ruijin hospital, and evaluate the prevalence of Staphylococcus aureus in nosocomial infections (NI). Methods Ant

5、imicrobial susceptibility of forty-three strains isolated from patients were examined by disc diffusion method; methicillin-resistant strains with mecA gene were typed by multiplex PCR method. MEGA3.1 software was applied to analyze the homology of the strains according to the susceptibility tests a

6、nd the gene typing methods. Results The rates of the resistance to penicillin and methcillin is the highest, especially the resistant methcillin is up to 62.8%. SCCmec typing method gave the result that only type II and type III strains were discovered, none of the type I and type IV were found. Rel

7、ative analysis showed phylogeny homologous strains exist. Conclusion Prevalence of certain types of mecA positive MRSA strains leading to epidemic outbreak.Key Words Methcillin-resistant Staphylococcus aureus; Genotype; multiplex PCR; antibiotic resistance；nosocomial infections金黄色葡萄球菌（Staphlococcus

8、aureus），简称金葡菌，是引起院内感染的重要革兰阳性病原菌之一。近年来，随着抗生素的广泛使用，其耐药现象日益严重，导致临床诊断和用药困难，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Methcillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 引起的院内感染 (nosocomial infection) 已经成为全世界严重的公共卫生问题。建立快速、可靠的检测和分型方法，对于相关卫生部门控制耐药菌株的流行具有非常重要的意义。MRSA的产生多数是由于获得了可转移性耐药基因mecA，在mecA阳性的MRSA菌株复制起始点附近有一特征性结构，此结构内含有mecA基因，并可

9、在以整体形式在不同菌株间相互传播，称为葡萄球菌染色体盒mec（(staphylococcal chromosome cassette，SCC mec）。对SCCmec进行基因分型是一种重要的MRSA的分型方法，目前国际上研究主要可将MRSA分为五种型别1-3，对于MRSA的流行病学研究具有重要意义。本研究对上海瑞金医院2007年7-8月临床分离的43株S.aureus进行药敏分型和SCCmec分型，并整合两种分型方法分析了菌株间的亲缘关系，旨在对感染菌株的耐药特点和流行病学特征有所了解。1 材料与方法1.1. 菌株来源 2007年7-8月上海交通大学医学院附属瑞金医院临床检验科收集的住院患者送

10、检标本（包括痰、咽拭子、尿、创面或伤口分泌物、血）中分离的医院感染菌株43株。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 25923，来自本教研室。1.2 细菌鉴定 所有分离菌株经全自动细菌鉴定仪（法国梅里埃）API Staph 系统进行生化鉴定。1.3 培养基和药敏纸片 MH琼脂干粉培养基购自上海中科昆虫生物技术开发有限公司。所用的药敏纸片包括庆大霉素(GM)、青霉素（P）、甲氧西林（MET）、优立新（SAM）、头孢唑啉（CZ）、万古霉素（VA）、四环素（T）、克林霉素（CL）、复方新诺明（SXT）、磷霉素（FM）、利福平（RA）、替考拉宁（TP）、左氧沙星（LVF）。均购自美国BD公司。1.4 药敏

11、试验 采用K-B法测定43株菌对13种抗生素药物的药物敏感性，结果依据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）2004年版进行判读。结果分别标记为敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。1.5 细菌DNA的制备 选择对甲氧西林耐药的菌株，吸取1.5mL的过夜培养菌液置于Eppendorf管中，离心沉淀后用小量细菌基因组抽提试剂盒（华舜）抽提细菌基因组DNA作为模板，按照试剂盒的说明书操作。1.6 基因分型 根据Genebank上mecA的基因序列设计引物mecA1和mecA2，从耐甲氧西林的菌株中筛选mecA阳性的样本。然后采用多重PCR的方法，设计针对SCCmecI型至IV型的6对引物，进行葡萄

12、球菌染色体盒分型（SCCmec）。各种靶基因引物序列和产物长度列于表1。PCR扩增条件均为：25L反应体系，2×Taq Master Mix (北京天根生化科技有限公司) 12.5L，上下游引物各1L、模板 1L，用ddH2O补至25L。在BIORAD PCR 扩增仪上设置扩增条件如下：95预变性4min, 94变性30s, 55退火30s, 72延伸1min,共循环30次，最终72延伸4min。扩增产物取10ul进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。PCR产物表现出495bp和342bp的为I型，表现出342bp，284bp和209bp的为II型，表现出414bp，243bp和209bp的为

13、III型，只有一条342bp的是IV型。表1 靶基因PCR引物序列4基因名称引物名称引物序列产物长度CIFCIF2 F2TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG495CIF2 R2ATTTACCACAAGGACTACCAGCKDPKDP F1AATCATCTGCCATTGGTGATGC284KDP R1CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGGMECMECI P2ATCAAGACTTGCATTCAGGC209MECI P3GCGGTTTCAATTCACTTGTCRIF4RIF4 F3GTGATTGTTCGAGATATGTGG243RIF4 R9CGCTTTATCTGTATCTATCGCR

14、IF5RIF5 F10TTCTTAAGTACACGCTGAATCG414RIF5 R13GTCACAGTAATTCCATCAATGCDCSDCS F2CATCCTATGATAGCTTGGTC342DCS R1CTAAATCATAGCCATGACCGmecAMecA1GTTGTAGTTGTCGGGTTTG446MecA2TCCACATTGTTTCGGTCT1.7 整合药敏试验和SCCmec分型结果，对mecA阳性的菌株用MEGA3.1软件进行菌株亲缘关系比较，并构建进化树。2 结果2.1 细菌鉴定 经全自动细菌鉴定仪鉴定，43株菌属于金黄色葡萄球菌种。2.1 药敏试验 43株金黄色葡萄球菌中有2

15、7株菌对甲氧西林耐药，MRSA菌株占到62.8。所以菌株对其它12种抗生素的药敏试验结果见表2,从表中可以看出，43株菌对青霉素的耐药率最高，达到90.7，对替考拉宁的耐药率最低，仅2.3。无万古霉素耐药菌株。表2 43株金黄色葡萄球菌对13种药物的耐药性抗菌药物MRSA(n=27)MSSA(n=16)总耐药率(%)庆大霉素青霉素优立新头孢唑啉万古霉素四环素克林霉素复方新诺明磷霉素利福平替考拉宁左氧沙星81.5（22/27）100（27/27）85.2（23/27）92.6（25/27）0（0/27）88.9（24/27）88.9（24/27）33.3（9/27）14.8（4/27）44.4（

16、12/27）3.7（1/27）74（20/27）12.5（2/16）75（12/16）6.3（1/16）0（0/0）0（0/16）18.8（3/16）6.3（1/16）0（0/16）6.3（1/16）0（0/16）0（0/16）0（0/16）55.8（24/43）90.7（29/43）55.8（24/43）58.1（25/43）0（0/43）62.8（27/43）58.1（25/43）20.9（9/43）11.6（5/43）25.6（12/43）2.3（1/43）46.5（20/43）2.2 SCCmec分型结果 43株菌中对甲氧西林耐药的共有27株。经筛查，mecA阳性的菌株为24株，占到8

17、8.9。SCCmec分型结果提示，在所有mecA阳性的菌株中，可检测出II型菌株9株，占37.5；III型菌株15株，占62.5。未见I型和IV型菌株的存在。2.3 整合后的菌株亲缘关系比较结果 将mecA阳性的24株菌结合药敏试验的分型结果，用MEGA3.1软件分析其同源性，构建进化树结果见图1。3 讨论金黄色葡萄球菌是引起医院和社区感染的重要致病菌，随着抗生素的广泛应用和各种侵入性医疗装置的应用，临床上耐药菌株不断增多，尤其是MRSA引起的院内感染，可引起爆发性流行，并可远距离播散。对院内感染的MRSA菌株进行耐药谱分析和基因分型对于控制MRSA的院内传播和爆发具有重要的流行病学意义。细菌

18、分型的前提是流行病学上相关的菌株源于单一亲代的克隆扩增，分型方法有生物型、药敏谱型、血清型和噬菌体型等表型方法和质粒分析、染色体DNA限制性内切酶分析、Southern杂交、PFGE、PCR分析等基因方法两大类。药敏谱型是细菌耐药性检测方面无可替代，并是医院感染菌株的流行病学调查的重要内容。本研究对院内分离的43株菌进行的药敏试验结果显示：大部分菌株呈现多重耐药性。其中MRSA的菌株对青霉素和头孢唑林的耐药率也较高，达100和92.6，提示该医院分离株对-内酰胺类抗生素耐药情况较普遍。对糖肽类抗生素如万古霉素完全敏感，替考拉宁也较敏感，耐药率仅为3.7。该药敏谱结果与国内其它医院分离株的药敏结

19、果较为相似，但庆大霉素和四环素的耐药率较其它报道略高5, 6。临床上治疗金黄色葡萄球菌引起的感染应严格根据药敏鉴定结果，明确是否为MRSA感染。对于MRSA菌株的治疗，仍以糖肽类抗生素为主，应合理规范使用抗生素，以免细菌耐药性的进一步加重。图1 mecA阳性的24株菌的系统进化树分析结果（数字为菌株编号） 现代分子微生物学的研究证实，MRSA耐药的主要机制是由于获得编码低亲和力的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的mecA基因，从而表现对甲氧西林耐药。MecA基因位于SCCmec上，SCCmec主要由mec基因复合体和ccr基因复合体组成，根据两种基因复合体组成的不同，SCCmec可以分成5种不

20、同的基因型别，是一种对MRSA进行分型的重要方法。本研究用PCR法扩增SCCmec基因分型的特征性基因，结果显示本医院院内感染菌株以III型为主，其次是II型，未见I型和IV型菌株。研究发现，来自不同地区的MRSA菌株流行的基因型别也不相同。有研究对来源于20个国家的304株MRSA菌株进行SCCmec分型，显示以I型和型为主7；另有研究加拿大院内感染分离MRSA菌株主要为SCCmec11型菌株8。一般认为，SCCmec I型为早期医院感染的MRSA菌株，SCCmec II和型为目前医院感染的MRSA流行株，SCCmecIV型为社区感染MRSA菌株。本研究结果符合目前医院感染的流行菌株，提示可

21、能存在院内感染。型菌株SCCmec基因盒存在携带氨基糖苷类耐药基因的PUB110质粒和携带红霉素耐药基因的Tn554转座子，型菌株具有携带四环素耐药基因的PT181质粒和Tn554转座子，故型和型菌株一般表现为多重耐药。整合药敏谱和基因分型结果，分析菌株之间的亲缘关系，结果发现了亲缘关系相近的菌株，提示这些菌株来源可能相同，具有追溯传染源的意义。此外，这些菌株可能存在小范围的爆发流行，因此应对这些耐药菌株采取及时而合理的控制。综上所述，该医院分离出的MRSA菌株存在多重耐药和小规模爆发流行的现状，给临床治疗带来了一定困难。但菌株对糖肽类抗生素仍较为敏感，本结果有助于临床合理使用抗菌药物。为预防

22、耐药金葡菌特别是MRSA的产生和传播，院内MRSA感染患者应注意隔离，防止交叉感染；强调消毒隔离制度、无菌技术的规范操作，尽量减少侵入性操作；加强综合治疗和护理质量。参考文献1.Ito, T., et al., Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant Staphylococcus aureusJ. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45

23、(5): 1323-36.2.Ma, X.X., et al., Novel type of staphylococcal cassette chromosome mec identified in community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus strainsJ. Antimicrob Agents Chemother, 2002, 46(4): 1147-52.3.Ito, T., et al., Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccrCJ. Antimicrob Agents Chemother,