金银花药材对照指纹图谱的建立及质量评价

1、金银花药材对照指纹图谱的建立及质量评价         Abstract:ObjectiveTo establish chromatographic fingerprint of Lonicera japonica Thunb. in order to control the quality of it. Methods The RP-HPLC was applied in chromatographic separation, and date were analysed by " Computer A

2、ided Similarity Evaluation" software to compare the quality of Lonicera japonica Thunb. Samples from different habitats.ResultsSamples from different habitats were of high similarity, and five common peaks were designated.ConclusionThe RP-HPLC fingerprint method is repeatable, feasible in analy

3、sis of Lonicera japonica Thunb. and can be used in quality assessment of Lonicera japonica Thunb.    Key words:Lonicera japonica Thunb；  RP-HPLC；  Fingerprint;   Similarity Evaluation    金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、红腺忍冬L. hypoglauca Miq.、山银花L

4、. confusa DC、或毛花柱忍冬L. dasystyla Rehd. 的干燥花蕾或带初开的花, 广泛分布于我国，具有抗菌、抗炎、抗病毒、护肝等多种功效1。金银花的化学成分研究表明，其含有有机酸类、三萜类、黄酮类、挥发油类成分，其中有机酸类主要为绿原酸、异绿原酸、新绿原酸等，是金银花抑菌、抗病毒的活性成分2，3。金银花大量用于中成药生产和 临床 处方，如临床上广泛使用的清开灵注射液、双黄连注射液、茵栀黄注射液、银黄注射液等均使用金银花作为原料之一。因此，建立金银花药材有效的质量评价方法，对不同产地金银花药材的质量进行系统的比较研究，固定药材产地，确保金银花药材的质量稳定，直接关系到金银花相

5、关药品和临床处方的疗效。近年来，指纹图谱技术被用于中药的质量控制，其优点在于可全面反映中药复杂的化学成分及其比例，有效地表征中药质量。我们根据国家药典委员会制定的“中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南（试行）”的相关要求，采用高效液相色谱法，建立了金银花药材对照指纹图谱，首次采用中国药典委员会推荐的 计算机 辅助相似度评价软件分析不同来源金银花药材的指纹图谱相似度，为金银花药材的质量控制提供有效方法。    1  仪器与试药    1.1  仪器Agilent 1100型液相色谱仪，Agilent1 G1314A

6、型紫外检测器，Agilent G1310A 型高效液相泵系统，Chemstations 色谱 工作 站，Discovery C18液相色谱柱（25 mm×4.6mm ID, 5micron），CBL 100型柱温箱，计算机辅助相似度评价软件（2004 A，中国药典委员会），S-5210DT型超声波清洗器（上海金利超声波仪器厂）。    1.2  试药绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所）；金银花药材购于各地药店或直接从产地收集，经作者鉴定均为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.；甲醇、磷酸分别为色谱纯和分析纯；水为去离

7、子水。    2  方法与结果    2.1  方法    2.1.1  参照物的选择及溶液制备绿原酸为金银花的主要成分，而且所选择的金银花药材供试品溶液提取方法很容易将绿原酸提取出来，在色谱图中容易辨认，所以选择绿原酸作为参照物。参照物溶液的制备方法：取绿原酸对照品适量，加50甲醇配制成每毫升含0.06 mg的溶液，即得。    2.1.2  检测波长及流动相的选择根据 文献 报道，绿原酸类化合物是金银花的主要活性成分，经测定绿原酸参

8、照物溶液和金银花药材提取液在327 nm处均有最大吸收，因此，选择327 nm为测定波长。在用同一浓度的样品溶液、色谱柱、流速（0.7 ml/min）、检测波长和HPLC仪器的条件情况下，通过对多种溶剂系统进行考察，最后确定的最佳流动相为甲醇-0.1%磷酸（4060），流速为0.7 ml/min，检测时间30 min。    2.1.3  提取方法的选择金银花中主要有效成分为绿原酸、异绿原酸，它们是奎宁酸和咖啡酸的酯，其中绿原酸含量高，是金银花及其相关制剂的活性指标成分。参照文献资料4，5，经对多种提取溶剂研究，结果表明，以50%甲醇溶液作为提取溶液进行

9、超声提取，能将金银花中绿原酸类成分充分提取，提取液中有效成份不需要进一步提取分离与富集，可以直接进样分析。    2.1.4  供试品溶液的制备取金银花药材，置硅胶干燥器中干燥24 h，研细，取约0.5 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，加50甲醇50 ml，超声处理30 min，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5 ml，置50 ml量瓶中，用50甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。    2.1.5  测定法及数据处理分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20 l，注入液相色谱仪，记录30min的色谱图。

10、用 中国 药典委员会推荐的“中药指纹图谱 计算 机辅助相似度评价 软件 ”（版本2004A）进行数据处理，将多个批次的色谱图进行比较，得到可全面反映多个色谱图特征的金银花药材的对照指纹图谱。以此模式为基准，计算每个色谱图与之相比较的相似度（范围应在0.901.99之间）。    2.2  结果    2.2.1  稳定性实验取山东产样品，按照供试品溶液制备 方法 制备供试品溶液，分别在0，1，2，3，4，5，6 h时间间隔内测定指纹图谱，观察各峰的相对保留时间、峰面积比值的变化及图谱的相似度。结果表明，各共有峰的相

11、对保留时间、峰面积的比值及色谱相似度基本稳定（RSD2.20，相似度1.00），符合指纹图谱制定的要求。    2.2.2  精密度实验取上述样品，制备供试品溶液，连续6次测定指纹图谱，结果表明，以绿原酸为参照物，各共有峰的相对保留时间、峰面积的比值及色谱相似度基本不变（RSD1.99，相似度为1.00）。    2.2.3  重现性实验取上述批号样品6份，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，测定指纹图谱。结果表明，6次测定结果稳定，各共有峰的相对保留时间、峰面积的比值及色谱相似度基本一致（RSD1.04，相似

12、度为1.00）。    2.2.4  金银花高效液相指纹图谱的测定    2.2.4.1  构建对照指纹图谱取10个批次不同产地的金银花药材，分别按照上述方法测定，记录色谱图。见图1。经“中药指纹图谱 计算机 辅助相似度评价软件”（版本2004A）处理，获得金银花高效液相对照指纹图谱。见图2。计算机辅助相似度评价 报告 结果见表1。    图1  10批次不同产地金银花药材指纹图谱    图2  金银花药材高效液相对照指纹图谱 

13、;   表1  10批次不同产地金银花药材计算机辅助相似度评价报告样品名称（略）     2.2.4.2  共有峰的确定根据10批次样品的测定结果，利用计算机模拟相似度计算软件处理，共确定了5个共有峰（编号见对照指纹图谱）。以绿原酸为参照，计算 统计 共有指纹峰的相对保留时间及峰面积比值（单峰面积占总峰面积大于10的共有峰）。结果见表2。    表2  金银花药材指纹图谱检测共有峰数据统计结果样 （略）     2.4.3  非共有峰统计计算了1

14、0批次供试品图谱中非共有峰总面积及占总面积的百分比，其非共有峰总面积占总峰面积均小于10，符合指纹图谱有关要求。    3  山东产金银花药材指纹图谱相似度评价    山东为忍冬主产区，俗称“东银花”“济银花”，产量大，质量好，销全国各地，是多种中药注射剂的原料产地，因此作者收集6个批次的山东产金银花药材，按照上述建立的指纹图谱测定方法检测，所得指纹图谱和已构建的金银花对照指纹图谱通过计算机辅助相似度评价系统评价相似度，为金银花药材的选用提供依据。6批次金银花药材的指纹图谱相似度评价结果分别为：0.987，0.932，0.9

15、98，0.954，0.939，0.971。    4  讨论    4.1  研究 采用HPLC色谱法，通过对10个批次不同产地金银花指纹图谱 分析 ，初步构建了金银花药材对照指纹图谱，并对山东所产6个批次金银花药材指纹图谱进行了相似度评价，结果表明，利用建立的样品提取、制备、色谱分离方法，金银花中有效成分能在色谱图中得到充分体现，所建立的色谱指纹图谱具有较大的稳定性和可控性。    4.2  指纹图谱的评价指标是供试品指纹图谱与该品种对照指纹图谱及供试品之间指纹图谱的相似性

16、，一方面应评价色谱的整体面貌，又要评价供试样品与对照指纹图谱之间总积分值（相对保留时间、峰面积比值）的变化。本文使用了“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”系统，为大量复杂的色谱数据的处理提供了方便。    4.3  本实验指纹图谱反映了金银花中主要有效成分绿原酸类化合物组成及相对比例，既可用于定性鉴别，也可用于定量分析，可用于金银花药材的栽培、贮藏、加工、 临床 使用的质量监控。    参考 文献 ：    1  邢俊波，李会军，李萍，等. 忍冬花蕾化学成分的研究J.中国新药杂志，2002，11（11）：856.    2  赵国玲，刘佳佳，林丹，等