饲粮锌水平对肉仔鸡组织锌转运蛋白基因表达的影响

1、饲粮锌水平对肉仔鸡组织锌转运蛋白基因表达的影响黄艳玲1,2,3 罗绪刚1,2* 吕 林1,2 刘 彬1,2(1.中国农业科学院畜牧研究所矿物元素营养室，北京 100094；2.动物营养学国家重点实验室，北京 100094；3.西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041)摘 要: 本文旨在研究饲粮中不同水平锌对肉仔鸡组织锌转运蛋白基因表达的影响。选用1日龄AA肉公鸡720只，随机分为8个处理组，每个处理6个重复，分别饲喂不加锌的玉米-豆粕型基础饲粮（对照组）和添加水平为20、40、60、80、100、120 和140 mg·kg-1 （硫酸锌）的饲粮, 试验期21d，分为1-7

2、日龄，8-14日龄和15-21日龄三阶段进行。结果表明：各日龄胰脏锌转运蛋白-2的基因表达均受到饲粮锌水平显著的影响（P< 0.01），7日龄时随饲粮锌添加量的增加呈明显的渐近线变化趋势（P< 0.01），而14日龄与21日龄均呈二次曲线变化趋势（P< 0.01）。关键词：锌；肉仔鸡；锌转运蛋白；基因表达锌是生物体必需的微量元素，参与了细胞内许多不同的代谢过程，因此细胞内锌的稳态平衡非常关键。为了在不同的条件下达到稳态平衡，细胞必须对锌的摄取率和排出率进行相应的调节。细胞内锌的稳态平衡是由包含在锌摄取、分泌以及细胞内储存/运输过程中的不同蛋白质协同作用来调节的。这些蛋白主要包

3、括金属硫蛋白（MT）以及锌转运蛋白（ZnTS）。MT通过细胞内结合的方式协助调节细胞内游离锌的水平，而锌转运蛋白主要通过调节锌的跨膜运输对细胞内锌的浓度进行调节。前人的研究已表明，鸡组织MT的含量及其基因表达与饲粮中锌含量密切相关1-4。鼠上的研究也表明，锌转运蛋白受饲粮锌的调节，且不同成员受锌影响的程度不同，并存在着一定的组织特异性5-7。Liuzzi等（2001）7同时研究了饲粮锌对大鼠ZnT1、ZnT2以及ZnT4基因表达的影响，结果表明ZnT2的基因表达对锌的反应最敏感。尽管目前还不知ZnT2 蛋白是否有同样的变化趋势，但已有证据表明，ZnT2 蛋白与ZnT2 mRNA之间有密切的关联

4、8,9。目前对锌转运蛋白的研究还只是处在起步阶段，一些成员的分布以及主要生物学功能还没有完全阐明，且大多的试验都采用体外方法进行，体内试验相对较少。而且，在现有文献中，所有试验均以啮齿动物为研究对象，至今没有见到在鸡上的研究，有必要进行进一步的研究。1 材料与方法1.1试验动物与饲粮选用北京华都肉鸡集团提供的720只商品代1日龄AA肉公鸡进行试验。参照美国NRC（1994）家禽营养需要量中肉仔鸡营养建议量，配制021日龄肉仔鸡不含锌的玉米-豆粕型基础饲粮，基础饲粮配方见表1。表1 基础饲粮组成和营养水平Table 1 Composition and nutrient levels of bas

5、al diets 项目 Items 03周 week日粮组成 Composition (%)玉米 Corn55.97豆粕 Soybean meal36.00豆油 Soybean oil3.60磷酸氢钙 CaHPO4 1.95石粉 Limestone1.16食盐 NaCl0.30蛋氨酸 DL-Met0.20赖氨酸 L-Lys 预混料a Premix0.32玉米淀粉锌c CornstarchZinc0.50合计 Total100.00营养水平 Nutrient levels代谢能ME（MJ/kg） 12.53粗蛋白b CP21.56蛋氨酸Met 0.54蛋+胱 Met+Cys0.91赖氨酸Lys1

6、17色氨酸 Trp0.30钙b Ca1.10有效磷 Available P0.46锌b Zinc (mg/kg)28.37a每kg预混料中含有Provided per kg of premix：VA 10000IU；VB11.6mg；VB2 (核黄素, riboflavin) 6mg；泛酸 (VB3 ) D-pantothenic acid (D-泛酸钙D-calcium pantothenate) 20 mg；VB63 mg；VB120.014mg； VD32600IU； VE20IU；VK3 2 mg；生物素 biotin 0.12mg； 叶酸folic acid0.8mg；烟酸(尼克酸)

7、 nicotinic acid (niacin) 30 mg； 胆碱 choline 1.3 g；Cu (as copper sulfate) 8 mg； Fe (as ferrous sulfate) 80 mg； Mn (as manganese sulfate) 100mg； I (as calcium iodate)0.35mg；Se (as sodium selenite) 0.15 mg。b实测值Analyzed composition.C锌替代等重的玉米淀粉添加1.2试验设计与饲养管理采用单因子安排的完全随机设计，将720只商品代1日龄AA肉公鸡随机分成8组，每组分6个重复笼饲养

8、，每个重复笼8只饲养于一个不锈钢镀塑肉鸡笼内。饲养管理按AA肉仔鸡饲养管理手册进行。试验期21天。每周末以重复笼为单位称空腹体重和耗料量。设8个锌（硫酸锌）添加水平分别为0、20、40、60、80、100、120和140 mg/kg，共组成8个处理组。1.3 样品的采集与制备试验第7、14、21日龄从每个重复笼按平均体重选取4只鸡于禁食一夜后全部屠宰，立即摘出肾脏和胰脏于-196液氮冻存，以备分析ZnT-2 mRNA水平；每重复笼4只鸡的样品合并为一个样品分析。配合试验饲粮时现场采样，研磨过200目筛后置于塑料瓶中低温保存以备分析。1.4 样品分析组织ZnT2 mRNA水平的测定： SYBR

9、Green实时荧光定量RT-PCR法（QRT-PCR）法。主要操作步骤为：用Trizol试剂（15596-026, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）一步抽提法提取胰脏细胞中的总RNA，用Ultrospec紫外-可见分光光度计（Ultrospec III, Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT）测其OD260、OD280，计算比值并定量，其OD260：OD280比值均在1.8以上。用0.8%的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。按照SuperScript III TM First-Strand Sy

10、nthesis System for RT-PCR试剂盒（12371-019, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）使用说明，合成cDNA模板。根据鸡MT、ZnT2序列和-actin cDNA序列，分别设计合成其扩增引物（表2）。在ABI7000荧光定量分析仪（7000HT, Applied Biosystems Incorporation, Foster, CA, USA）上采用标准曲线相对定量法进行ZnT2基因表达的荧光定量分析。定量体系（25ul）为：2×SYBR MasterMix （4309155, Applied

11、 Biosystems Incorporation, Foster, CA, USA）12.5ul；引物F（10M/L）1.0ul；引物R（10M/L）1.0ul ；CDNA 1.0ul；ddH2O 9.5ul。根据仪器由标准曲线自动生成的各样品的荧光值对胰脏ZnT-2 mRNA进行相对定量。每个样品重复进行三次PCR反应，以三次PCR反应中ZnT-2与管家基因-actin荧光值的平均值作为该样品的观察值进行统计分析。胰脏ZnT-2 mRNA水平以同一体系中ZnT-2与管家基因-actin的荧光值的相对比值来表示。表2：鸡ZnT-2及-actin（管家基因）的引物序列TABLE 2. Prim

12、er sequence of chicken, zinc transporters-2 (ZnT-2) and -actin (house-keeping gene)引物引物序列位置及扩增长度PrimerPrimer sequencePosition and lengthZnT-2上游（ZnT-2 F）TCT TCT CCG TGC TGG TGC T526-624ZnT-2下游（ZnT-2 R）CGG CGT TGA AAT CCA TCC99 bp-actin上游（-actin F）GAG AAA TTG TGC GTG ACA TCA685-818-actin下游（-actin R）CC

13、T GAA CCT CTC ATT GCC A134 bp1.5 数据统计和处理采用SAS8.0统计软件中的一般线性模型（GLM）中单因素方差分析，对所有试验数据进行方差分析，每个重复笼为一个试验单元。2 结果与讨论前人研究表明，鼠肾脏ZnT2 mRNA对锌的反应最敏感10，且胰脏为肉仔鸡中锌反应最敏感组织11-13，故本试验选取肾脏和胰脏组织来进行ZnT2 mRNA分析。本试验荧光定量结果显示肾脏中ZnT2的表达很弱，几乎没有表达，故本文没有列出肾脏的结果。这表明，不同种类的动物中ZnT2基因表达存在组织特异性，在鼠中肾脏为其敏感组织，在肉仔鸡中则不然。胰脏ZnT2 mRNA结果列于表3，拟

14、合曲线见图1。由表3可见，在各日龄阶段，饲粮锌含量均显著影响胰脏ZnT2 mRNA水平（P<0.01）。胰脏ZnT2 mRNA水平在7日龄时随饲粮锌添加量的增加呈明显的渐表3：饲粮锌水平对各日龄肉仔鸡胰脏ZnT2 mRNA水平的影响1Table3. Effect of dietary zinc on tissue ZnT2 mRNA level of broiler chicks1锌添加水平胰脏ZnT2 mRNA （R）Added Zn level（mg/kg）7日龄 D714日龄 D1421日龄 D2100.0042c0.0094d0.0271f200.1003b0.0524c0.09

15、35e400.1100b0.1250ab0.1058de600.1461ab0.1430a0.1386bc800.1705a0.1369ab0.1524ab1000.1455ab0.1258ab0.1184cd1200.1380ab0.0965b0.1035de1400.1364ab0.0614bc0.1765a集合标准误 Pooled SE0.0180.0170.016P-值 P-valuezinc<0.0001<0.0001<0.0001Zinc linear<0.0001<0.0001<0.0001Zinc quadratic<0.0001<

16、;0.0001<0.00011每个数据代表6个重复（n=6）的平均值1Results are means with (n=6) per treatmenta, b 同一列中数值具有不同字母上标者差异显著(P<0.01)a, b Means with different superscripts within the same column differ significantly (P<0.01).Fig1图1近线变化趋势，而14日龄与21日龄均呈二次曲线变化趋势。胰脏ZnT2 mRNA水平与饲粮锌添加量间拟合的方程为（图1）：7日龄Y=0.1471-0.1424e-0.04

17、98x（P=0.0012，R2=0.9321）14日龄Y=0.0068+0.0035x-0.000022x2（P=0.0003，R2=0.9606）21日龄Y=0.030+0.0030x-0.000020x2（P=0.0029，R2=0.9457）分子生物学技术的发展和应用使快速测定痕量mRNA成为可能。荧光定量PCR（Real-Time RT-PCR）为监测基因表达水平的变化提供了一个高灵敏度和可重复性方法。这种新的分子生物学手段的出现为发现新的营养标识物开拓了前景14。锌转运蛋白（Znic Transporters，ZnTs）为近年来才发现的一组结构和功能相近的蛋白质，具有六个跨膜区域并且

18、有一个区域含有丰富的组氨酸，此区域可能含有锌离子的结合位点，到目前为止已发现了至少9种ZnTs。研究表明，ZnTs在维持细胞锌稳态平衡方面起着重要的作用，其与MT协同作用对细胞内锌的浓度进行调节，保证细胞内锌的稳衡。MT通过细胞内结合的方式协助调节细胞内游离锌的水平，而ZnTs主要通过调节锌的跨膜运输对细胞内锌的浓度进行调节9。Cousins等（2003）14报道，锌转运蛋白基因可能用作反映机体内锌营养状况的指标。不同锌转运蛋白家族成员对锌反应的敏感度不同。Liuzzi等（2001）7在大鼠中研究了饲粮锌对不同锌转运蛋白成员ZnT-1 、ZnT-2和ZnT-4基因表达的影响。结果表明，ZnT-

19、2 mRNA对锌的反应最敏感。Blanchard等（2001）10研究表明，肾脏ZnT-2 mRNA可以作为大鼠锌营养状况的评价指标。但在鸡上还未见相似的研究。本研究首次发现饲粮锌水平对肉仔鸡胰脏ZnT-2 mRNA水平有显著的影响，各日龄胰脏ZnT-2 mRNA水平均随饲粮锌添加水平的增加呈现二次曲线或渐近线变化趋势，这说明胰脏ZnT-2 mRNA水平可以敏感的反应肉仔鸡锌的营养状况，提供了一个新的锌营养标识。另外，胰脏ZnT2 mRNA水平在7日龄时随饲粮锌添加量的增加呈明显的渐近线变化，而14日龄与21日龄均呈现二次曲线变化，这表明在锌的稳态平衡调节中，ZnT2可能发挥着第一道防线的作用

20、，在其不能有效维持锌的稳态平衡时，其它锌稳恒调节蛋白会发挥更大的作用。黄艳玲（2007）15在同样的试验条件下研究了肉仔鸡饲粮锌水平对胰脏MT mRNA水平的影响，结果表明，胰脏MT mRNA随饲粮锌水平的增加呈显著的线性变化，这可能也说明了在饲粮锌含量达到一定水平，ZnT2不能有效维持锌的稳态平衡时，MT发挥着更重要的作用，具体机理有待进一步的研究证实。3 结论本试验数据表明，胰脏ZnT-2 mRNA水平可以敏感的反应肉仔鸡锌的营养状况，提供了一个新的锌营养标识。在肉仔鸡体内锌的稳恒调控作用中，ZnT-2可能在初期发挥着比较重要的作用，为锌稳态平衡的第一道防线，而MT则在后期发挥着重要的作用

21、。参考文献：1 Oh, S. H., H. Nakaue, J. T. Deagen, P. D. Whanger, and G. H. Arscott. 1979. Accumulation and depletion of zinc in chick tissue metallothionein. J. Nutr. 107: 1720-1729.2 McCormick, C. C. 1984. Induction and accumulation of metallothionein in liver and pancreas of chicks given oral zinc: a ti

22、ssue comparison. J.Nutr. 114: 191-203.3 Sandoval, M., P. R. Henry, X. G. Luo, R. C. Littell, R. D. Miles, and C. B. Ammerman. 1998. Performance and tissue zinc and metallothionein accumulation in chicks fed a high dietary level of zinc. Poult. Sci. 77: 1354-1363.4 Cao, J., P. R. Henry, S. R. Davis,

23、R. J. Cousins, R. D. Miles, R. C. Littell. C. B. Ammerman. 2002 Realtive bioavailability of organic zinc sources based on tissue zinc and metallothionein in chicks fed conventional dietary zinc concentrations. Anim Feed Sci Tech. 101: 161-170.5 McMahon, R. J., and R. J. Cousins. 1998. Regulation of

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26、on. J. Nutr. 132: 3280-3285.9 Liuzzi, J. P, and R. J. Cousins. 2004. Mammalian zinc transporters. Annu. Rev. Nutr. 24: 151-172.10 Blanchard, R. K., J. B. Moore, C. L. Green, and R. J. Cousins. 2001. Modulation of intestinal gene expression by dietary zinc status: effectiveness of cDNA arrays for exp

27、ression profiling of a single nutrient deficiency. Proc Natl Acad Sci U S A. 98: 13507-1351311 McCormick C C. Induction and accumulation of metallothionein in liver and pancreas of chicks given oral zinc: a tissue comparison. J.Nutr. 1984, 114: 191-203.12 Williams S N, Miles R D, Ouart M D, Campbell

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29、 of the selectivity of zinc deprivation and excess on genes expressed in human THP-1 mononuclear cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 100: 6952-6957.15 黄艳玲. 2007. 肉仔鸡实用饲粮中锌适宜水平及有机锌源相对生物学利用率研究. 中国农业科学院博士学位论文, p 33-38.The Effect of Dietary Zinc Level on tissue Zinc transporters Gene Expression in Broiler Chicks Huang Yan-ling1,2,3, Luo Xu-gang1,2* Lu Lin1,2 Liu Bin1,2(1. Mineral Nutrition Research Division, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100094, China; 2. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Beijing 100094, China;3. Colle