温度因素对薯蓣多糖测定的影响研究(

1、温度因素对薯蓣多糖测定的影响研究 基金项目：国家科技基础性工作和社会公益研究专项资金资助（NO. 2003DEB6J074）； 国家科技支撑计划项目资金资助（NO. 2006BAD06B05）。作者简介：张卫明（1957-），男，安徽芜湖人，研究员，主要从事农林特产资源保护与产业开发。通讯方式：botanyzh,卫明1，单承莺1，杭悦宇2，姜洪芳1，张玖1（1南京野生植物综合利用研究院，210042；2中科院/江苏省植物研究所，210014）摘要 目的：考察水提温度、原料干燥温度等因素对薯蓣多糖含量测定的影响。方法：以河南铁棍山药、昆明栽培山药、浙江文成参薯以及福建

2、三明褐苞薯蓣为试样，在不同温度下干燥和提取，采用硫酸-苯酚法测定多糖含量。结果：样品的干燥温度对多糖含量测定结果影响不大，而水提温度对于多糖含量测定结果影响极大。结论：薯蓣多糖测定中的提取温度以不超过65为宜，提取温度过高时会因原料中淀粉溶出而导致多糖测定结果大幅虚高。关键词 薯蓣属，山药，参薯，褐苞薯蓣，多糖测定薯蓣属（Dioscarea）是薯蓣科中最大的一个属。全世界薯蓣科有6属约650余种，薯蓣属就占了600种以上，主要分布在东南亚、非洲及中美、南美等热带和亚热带地区，少数几种分布于欧洲和北美洲。我国约有55种、11变种、1亚种，主要分布于长江以南1。薯蓣属植物大多具有较粗大的地下块茎或

3、根状茎，是该属植物的主要食用或药用部位。其中薯蓣（D. polystachya Turcz., 原称D. opposita Thunb）的块茎又称山药，早在神农本草经中就被列为上品，具有健脾、补肺、固肾、益精等功效，是药食两用的佳品。同属的山薯（D. fordii）、褐苞薯蓣（D. persimilis）、参薯（D. alata）等在部分地区也作为山药主流商品使用，成为较有影响的地方性药材。山药块茎中主要含有淀粉、蛋白质、多糖及黏液质，并含有多种游离氨基酸、尿囊素、胆碱等成分2。其中多糖被认为是山药补益作用的活性成分，因而普遍受到关注，常被作为药材及其制剂的品质评价和质量控制指标。但是薯蓣属植

4、物的多糖比较复杂，文献报道不一。山药的黏液质是一类含磷的的复合多糖，Satoh等3早年报道它是甘露聚糖和植酸的复合物，山药黏液质B（Dioscroreamucilage B）后又被阐明是甘露聚糖和含磷蛋白质的复合物，分子量约为200万，其中蛋白质约占64%。山药中另一类重要的多糖为杂多糖，例如赵国华等4分离到的RDPS-1，平均分子量为41000，由摩尔比为1: 0.4: 0.1的葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成。Tadashi Kiho等5分离到的山药多糖Y-N分子量约为370000，其糖基组成则为6:1摩尔的甘露糖和葡萄糖。杭悦宇等6测得的商品山药多糖的糖基摩尔比则为6.45（甘露糖）:1（葡萄

5、糖）:1.26（半乳糖）。不同文献报道的山药多糖的提取得率及其糖基组成随提取温度的不同而差异极大。以冷水或温水浸提时，得到的是以葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成的杂多糖，得率也较低，一般不超过1%。而以沸水煮提时，得到的则主要是葡聚糖7，且得率往往可以超过10%。由于这些文献采用的是不同的研究材料，相互间很难进行严格的比较，这对山药及其药源替代品的品质评价带来了很大的不便。鉴于近期的研究报告（论文、课题鉴定材料等）中，温浸和煮沸两种不同的提取方法仍在分别被采用，本文以河南铁棍山药、昆明栽培山药、浙江文成参薯以及福建三明褐苞薯蓣为试验材料，比较了水提温度对多糖含量测定结果的影响。黏液质作为一类复合多糖

6、，也应该计入总多糖。众所周知，去皮后的新鲜山药表面粘滑，但若干燥后再复水处理，粘滑程度则大为降低。这一现象提示，作为粘液质的蛋白复合多糖在脱水后其立体精细结构可能发生了某些改变。那么干燥温度是否会显著影响这类复合多糖的提取率并进而影响总多糖的测定结果？为此，本文就样品干燥温度也进行了适当的对比试验。1 材料与方法1.1 实验材料薯蓣（D. polystachya）样品2个：分别采自河南温县（铁棍山药）与云南昆明；参薯（D. alata）样品1个：采自浙江文成；褐苞薯蓣（D. persimilis）样品1个：采自福建三明。以上样品均为当地栽培品种，采集时间同为当年11月上、中旬，均经中科院/江苏

7、省植物研究所杭悦宇研究员鉴定。样品（鲜样）削皮、切丁后置65烘箱内干燥，粉碎成40目粗粉，部分直接供试，其余则根据实验设计于105干燥至恒重后供试。1.2 药品与试剂无水葡萄糖、尼泊金乙酯、苯酚、浓硫酸、乙醇、碘、碘化钾等，均为市售分析纯。1.3 仪器恒温水浴锅（北京市医疗设备总厂），超声波装置（BRANSON-200，U.S.A.），精密天平（EL-410S，U.S.A.），紫外分光光度计（TU-1800，北京普析通用仪器有限责任公司）。1.4 实验方法1.4.1 多糖提取与测定1.4.1.1 标准曲线的绘制精密称取105干燥至恒重的无水葡萄糖0.100g，蒸馏水溶解并定容至100mL，精密

8、移取10mL，再次定容至100mL，此时终浓度为0.10mg/mL。精密吸取葡萄糖标准溶液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00mL于10mL具塞试管内，补充水至2.00mL，另取一支空管加入2.00mL蒸馏水作对照。每管各精密加入浓度20g/L的苯酚溶液（新鲜配制）1mL，浓硫酸5mL，混匀，放置5min，沸水浴加热显色5min，冷水浴冷却30min，在485nm处测定吸光度。测定结果见表1，绘制的标准曲线见图1。标准方程为y=5.8884x+0.0618（R2=0.9990）。表1 葡萄糖含量梯度液的吸光度12345678葡萄糖含量（mg）0.010

9、0.0200.0400.0600.0800.1000.1500.200吸光度（A485）0.1080.1690.2970.4220.5510.6600.9491.224图1：葡萄糖标准曲线1.4.1.2 样品含量的测定称取以设定温度（见1.4.2.2）干燥的样品40目粗粉1.0g左右，精密称定。置250mL三角瓶中，加入100mL80%乙醇，回流2h，冷却后用滤纸滤去乙醇溶液，再次加入100mL80%乙醇，回流1.5h，冷却过滤，将滤纸和滤渣置三角瓶中一起烘干，精密加入99mL蒸馏水，1mL3%尼泊金乙酯溶液，称重，置水浴锅中以设定条件（见1.4.2.1）提取3h。取出静置，冷却，补加蒸馏水至

10、原重，过滤，取中段滤液，密封置于冰箱4下保存。集齐所需样品滤液后，每份精密移取1.00mL，置10mL具塞试管内，加入蒸馏水1.00mL，按1.4.1.1节自“加入苯酚溶液”起操作，测定吸光度（每份样品做3个平行管）。根据标准曲线计算出样品中葡萄糖含量，再乘以系数0.9换算为多糖（以葡聚糖计）含量，统一按绝干品计。1.4.2 不同提取温度和样品干燥条件对多糖测定结果的比较1.4.2.1提取温度对多糖测定结果的影响将1.4.1.2节操作中水浴浸提温度设为45、55、65、80和100五个水平，样品干燥条件设定为105，以观察提取温度对多糖提取率的影响。其中45、55、65和80水浴提取时辅以超声

11、波处理（每小时用超声波处理一次，每次15min）；100沸水浴提取需冷凝回流，不再超声波处理。1.4.2.2 样品干燥条件对多糖测定结果的影响将1.4.1.2节操作中称取样品的干燥条件设为65和105两个水平，而水浴浸提温度设定为45和80，以观察多糖提取率是否受样品干燥温度的影响。65下干燥的样品计算时再以其干燥至105恒重时的干燥失重率（含水率）进行修正。1.4.3 不同提取温度下所得溶液碘色反应比较取105干燥处理的样品在提取温度分别为45、55、60、65、70、75、80和100下按1.4.1操作，提取所得的溶液进行碘色反应，以检验水提液中是否有淀粉溶出。2 结果与讨论2.1提取温度

12、对多糖测定结果的影响（见表2）表2 提取温度对多糖测定结果的影响（n=3）样品提取温度多糖含量（%）相对平均偏差（±%）450.531.34550.660.57河南铁棍山药650.731.60805.710.231008.331.32450.872.51550.931.05昆明山药651.532.90807.001.0210010.023.49450.650.58550.730.63浙江参薯651.081.368014.391.0610015.913.59450.441.82550.601.25福建褐苞薯蓣650.780.62808.761.751009.712.432.2样品干燥条

13、件对多糖测定结果的影响（见表3）表3 样品干燥温度对多糖测定结果的影响（n=3）样品实验条件多糖含量（%）相对平均偏差（±%）河南铁棍山药105干燥，45提取0.531.3465干燥，45提取0.560.59105干燥，80提取5.710.2365干燥，80提取5.572.53昆明山药105干燥，45提取0.872.5165干燥，45提取0.713.46105干燥，80提取7.001.0265干燥，80提取6.802.80浙江参薯105干燥，45提取0.650.5865干燥，45提取0.610.34105干燥，80提取14.391.0665干燥，80提取13.693.05福建褐苞薯蓣

14、105干燥，45提取0.441.8265干燥，45提取0.452.36105干燥，80提取8.761.7565干燥，80提取8.880.972.3不同提取温度下所得溶液碘色反应比较结果（见表4）表4 不同提取温度下所得溶液碘色反应结果样品45556065707580100河南铁棍山药昆明山药浙江参薯福建褐苞薯蓣注：“”表示遇碘显蓝色；“”表示遇碘未显蓝色上述结果表明：样品的干燥温度对多糖测定结果影响不大，而水提温度对于多糖测定结果影响极大。由结果可知，当水温由45升至55时，样品多糖含量分别提高约1.11.4倍；升至65时，样品多糖含量分别提高约1.41.8倍；而升至80时，河南铁棍山药和昆明

15、栽培山药多糖含量分别提高约8倍、11倍，而褐苞薯蓣和参薯多糖含量更是大幅提高约20倍、22倍；升至100时，两种山药样品多糖含量分别提高12倍、16倍，而褐苞薯蓣和参薯多糖含量则是大幅提高约22倍、24倍。可见在水温4565的区间内，所有样品多糖含量基本按相似比例小幅升高，而当温度达到80以上的高温时，样品中的多糖含量则是以10倍、20倍的比例大幅激增。这种多糖含量随样品提取温度的升高而大幅度攀升的现象，除去可以用强化了多糖的浸出条件来解释之外，应该在很大程度上还与样品中所含的大量淀粉有关。当提取温度高于淀粉糊化温度时，将导致一部分淀粉被溶出，进而掩盖了含量本不甚多的杂多糖。这就是为什么热水提

16、取物主要是葡聚糖6的原因所在。从碘色反应结果可以看出，70是山药淀粉溶出的一个临界值，此时多数样品中已开始有淀粉溶出。当提取温度高于75时，所有样品提取液中均已含有淀粉。乔善义等8从商品山药水煎液中分离到分子量分别为63000和7400Dal.的两个葡聚糖，经波谱法测定，其结构通式为-D-Glc(14)-n。这个结构通式与淀粉一致。具有这类结构的多糖一般易受-淀粉酶的作用而在消化道内被水解成葡萄糖，因而不宜视为山药的活性成分。从这一点上说，在测定山药多糖含量时，其提取温度不应超过一般淀粉的最低糊化温度，以本文实验结果来看，不宜超过65，以免淀粉溶出，导致结果大幅度虚高。参考文献：1 裴鉴等,中

17、国植物志（第16卷，第1分册）M. 北京: 科学出版社, 1985, 541202 江苏新医学院编著,中药大辞典M. 上海: 上海科技出版社, 1986, 1763 Satoh T. Chemical constitution and structure of the yam (Dioscorea batatas Decene f. Icho) I. Mannan J. Nippon Kagaku Zasshi, 1967, 88(9): 9824 赵国华, 李志孝, 陈宗道. 山药多糖RDPS-I的结构分析及抗肿瘤活性J. 药学学报, 2003, 38(1), 37415 Tadashi K

18、iho, Chihiro Hara, Shigeo Ukia. A Glucomannan from the Tubers of Dioscorea japonica Thunb.J. Chem. Pharm. Bull., 1985, 33(1): 2702756 杭悦宇, 秦慧贞, 丁志遵. 山药新药源的调查和质量研究J. 植物资源与环境, 1992, 1(2): 10157 陶乐平, 吴东儒. 薯蓣多糖的分离、纯化、组成及其某些性质J. 安徽大学学报, 1988, 3: 1028 乔善义, 王立岩, 赵毅民, 等. 山药多糖的提取分离和结构测定J. 中国天然药物, 2003, 1(3),

19、 155157Study on Effect of Temperature Factor in Determination of Polysaccharide from Chinese yamZhang Weiming1, Shan Chengying1, Hang Yueyu2, Jiang Hongfang1, Zhang Jiu1(1, Nanjing Institute for the Comprehensive Utilization of Wild Plant, Nanjing, 210042;2, Institute of Botany, Jiangsu Province and

20、 the Chinese Academy of Sciences, Nanjing, 210014)Abstract: Objective: To investegate the effect of two factors, the temperature in water extraction and the temperature in dry process of raw material, which affect the result of polysaccharide determination. Method: Four species, Dioscorea polystachya from Henan province (Tiegun yam), D. polystachya from Yunnan province (Ku