生物学中的组织培养

1、生物学中的组织培养一、组织培养(Tissue culture)的含义组织培养，简单地说即把来自机体的细胞、组织或器官放于类似于体内的体外环境中使其存活或/和生长、增殖。严格地区分，它又可分为细胞培养(cell culture )：指细胞在体外的生长、增殖，但培养中的细胞不再结合成组织；组织培养：指组织在体外存活生长，并保持其结构和/或功能及进行分化；器官培养(Organ culture)：指器官的原基、全部或部分器官在体外的存活生长，并保持其结构和/或功能及进行分化。但组织培养一词又常泛地指各种体外培养。更广义地说，组织培养可包括人及动物的组织培养，植物的组织培养以及病毒培养等。各种不同的组织

2、培养在方法上虽有其不同和特殊要求，但它们又有共同的基本原则和技术。本文主要从人和动物细胞培养的角度加以介绍。二、组织培养技术的出现和发展早在19世纪末就开始了对活细胞的体外观察与保存工作。1885年Roux 用生理盐水培养鸡的神经板，发现它可在盐水中生活一段时间。 1887年 Arnold用一种巧妙的方法培养白细胞，他将赤杨木的髓质薄片浸于蛙的体液中，然后种植到蛙的皮下，当将髓片取出置于盐水中时，可观察到白细胞从髓片上向盐水内移动并能较长时期保持它的生活力。1903年Jlly分别将皮肤及白细胞培养于腹水及血清中，细胞存活可达一周到一个月，并看到了细胞分裂。但真正的组织培养应归功于1907年Ha

3、rrison的努力，他为探讨神经纤维的真正来源，从蛙胚中分离出一部分神经管，培养在一滴蛙的淋巴液中，成功地看到了神经纤维的末端不停地进行阿米巴运动，其中一根神经纤维在25分钟之内长到20微米，另一根在50分钟内长到25微米，最长的达到了200微米。这一发现不仅解决了当时争论不休的神经纤维的起源问题，也是在后来组织培养中悬滴培养法的开始。1912年Carrel发现鸡胚浸出液对多种细胞生长有高度促进作用，他将7天鸡胚心脏的组织块培养在血浆和鸡胚提取液的混合物中，当细胞生长出晕后再把它分成两分进行培养，在当时没有抗菌素，所以细菌污染是一个最大的困难，但由于Carrel是一个有成就的实验外科学家，有丰

4、富的无菌操作知识，所以在他的努力下鸡胚细胞的培养连续维持了34年之久。虽然由于经常加入新鲜的胚胎浸出液而使人怀疑是否带入了新的细胞，但他使用的培养液，采用的无菌技术，以及后来设计的培养瓶(卡氏瓶)等都是对组织培养的重要贡献。特别是他的连续培养，为后来的传代培养奠定了基础。大约与此同时，在Carrel等人工作的影响下，一些学者开始了细胞培养中的营养成分，培养液的渗透压，酸碱度等因素的研究。从而设计出了能长期维持动物组织、细胞生存的各种人工培养液，其中1950年Morgan等人经过大量研究设计的“199”培养液至今仍广泛用于人及哺乳动物细胞的培养。1943年Earle用致癌物20-甲基胆蒽处理来源

5、于C3H小鼠的结缔组织培养物，获得了能回种于小鼠体内而生长成肉瘤的长期培养的细胞系，定名为L细胞系。1951年Gey成功地由人的宫颈癌组织建立了能在体外连续长期培养的Hela细胞系。这些细胞系至今仍在世界各国广为应用。我国细胞学工作者在组织培养方面也有一定贡献。如早在1953年鲍鉴清就培养了皮肤、睾丸、卵巢、羊膜、腹膜等组织。陈瑞铭(1957年)设计了一种擦镜纸的器官培养法，成功地培养了大鼠的肝、胰、脑、垂体、甲状腺、肾上腺等器官。何申等(1959年)建立了来源于人体的骨软骨肉瘤细胞株。三、组织培养的基本条件1 无菌及灭菌由于要维持细胞在体外长时间生长、繁殖，所以在培养过程中的全部用具及操作过

6、程必须保证无菌，一旦有细菌污染细胞则不能继续存活。因此所用器具应首先进行严格清洗，然后再进行高压灭菌或干烤灭菌。对不能用高压或干烤灭菌的液体可用除菌滤器除菌。过去的操作环境一般在无菌室(密封，使用前用紫外线杀菌)进行。近年多应用国产洁净工作台(借助空气过滤及高速吹风除菌)进行操作。亦可二者结合应用。2 培养基(medium)人工培养基的成分主要含有各种氨基酸，维生素，糖和无机盐等，并使其有与体液相等的渗透压，同时加入适量的碳酸氢钠，以调节其酸碱度，使pH维持在左右。目前常用的人工培养基种类很多，如：“199”、“RPMI1640”、伊格(Eagle)、费歇(Fischer)等等。它们之间的区别

7、主要在含有氨基酸、维生素等的数量和种类上有所不同。在应用时可根据所培养的细胞类型及自己的经验而选择。但是，目前无论使用哪种培养基一般都要加入520的动物血清，最常用者为初生的小牛血清，其次，马血清、人血清等亦有应用。由于对血清的成分还不完全清楚，所以它对培养细胞的作用机理也还不十分了解。近来对无血清培养亦有文献报道，但这一问题尚在研究之中。当然，理想的人工培养基最好完全模拟体内环境，不过目前尚未达到。3 培养瓶和培养皿液体培养常用长方形培养瓶，有100ml，30ml， 15ml不等，此外还有扁圆形的卡氏瓶以及适用于微量培养的多孔微量培养板等。在二氧化碳培养箱中进行开放培养时多用培养皿，同时它也

8、被用于半固体培养。国内所用培养瓶(皿)均采用优质中性玻璃制成，便于洗涮及反复应用。但国外现已普遍采用塑料制品。4 温度及二氧化碳用培养瓶进行培养，一般放于37恒温箱中即可，目前国外已普遍将细胞接种于培养皿内，在含510的二氧化碳的空气环境中进行培养。一定量的二氧化碳有利于酸碱度的维持及细胞生长。二氧化碳培养需要放在二氧化碳培养箱中。二氧化碳培养箱，它除可维持37恒温之外，还可维持一定的二氧化碳浓度，虽然近年来国内已有产品，但价格仍较昂贵，不易推广使用。用真空干燥器充以含510二氧化碳的空气来代替二氧化碳培养箱可以达到同样目的，这种方法目前已为国内许多实验室所采用。四、组织培养方法的基本类型1

9、液体培养(Liquidculture)使细胞在液体培养基中生长，目前应用最广。以细胞在培养瓶中的存在方式区分，它又分为两种：单层培养(monolayer culture)：培养的细胞贴附于培养瓶(皿)底面的壁上，长成一层单层细胞的薄片。悬浮培养(suspension culture)：培养的细胞悬浮于培养瓶内的培养液中，不贴于瓶壁。亦有的培养物一部分细胞贴壁生长，另一部分细胞悬浮生长。以培养的目的区分，用液体培养法(包括单层培养和悬浮培养)又有以下几种：原代培养(Primary culture)：即将直接取自机体的组织块或细胞如：血细胞、胸腔或腹腔的游离细胞或将组织取出后在体外制成的分散细胞放

10、入培养瓶(皿)中进行培养，在进行传代之前称为原代培养。原代培养的细胞不断增殖，细胞密度增加，如不传代一般大部分细胞在短期内死亡，存活的细胞亦不能进行正常增殖。原代培养可作为建立细胞系或细胞株的开始，亦可进行短期的实验研究。传代培养(Subculture)：把原代培养的细胞分开接种于新的培养瓶(皿)中，称为“传代”(Passage)，每分开接种一次为一代。一般所说的培养细胞的“代数”即由此计算而来。克隆培养(Clone culture)：从原代或传代培养的细胞中分离出单个细胞并使其增殖或使单个细胞增殖后再进行分离，称为克隆培养。细胞系(Cell line)和细胞株(Cell strain)的培养

11、：把原代培养的细胞连续传代即称为细胞系。从原代或传代培养的细胞中选择出具有特殊性质或特征的细胞，使其克隆化，并在以后的连续培养中保持这种特殊性质或特征，即称为细胞株。2 半固体培养(Semisolid culture)在培养液中加入左右的琼脂，使培养基成为半固体的胶冻状态，细胞在其中增殖而不脱离原位。从而由一个细胞增殖而来的细胞聚集在一起，形成一个集落。它可用于对增殖细胞的计数，进行细胞克隆的选择以及对正常细胞恶变鉴定的指标。同时更广泛地用于对造血干细胞的培养。五、组织培养在生物学研究中的地位和应用我们知道生物学的研究对象是有生命的生物，而那些构成生命物质的蛋白质、核酸、脂类、糖类及其它分子都

12、不能单独地完成生命过程，只有当这些分子按一定方式构成细胞之后才能表现出生命现象。因此，细胞不仅是构成生物机体的基本组成单位，也是研究一切生命现象和本质的基本材料。在组织培养技术未完善之前，用于生物学研究的细胞主要来自整体动物，其缺点在于对细胞本身只能进行死后观察，同一组织中的不同细胞不易分开，并且常夹杂着其它组织成分，以及实验周期长，材料来源不便等。而用体外培养的细胞则可在细胞水平直接观察细胞的生长、增殖、分化等动态过程，从而研究它们在各种因素作用下的变化规律。同时它又可将实验条件直接作用于细胞，而不受体内神经、体液等因素的干扰。特别是对不能直接用人体进行实验的研究，可将所要研究的人体细胞取下来通过组织培养进行研究。组织培养不仅是细胞学研究中的一种重要方法，也是生物学许多学科研究中的一项基本条件和技术。如：在肿瘤学研究中，应用细胞培养可以研究引起细胞癌变的因素和原理，研究杀灭癌细胞的药物；在免疫学中可用培养细胞生产各种病毒疫苗及抗体等；在遗传学研究中首先要通过细胞培养才能制出供进行分析的染色体标本。特别是在一些新型的生物学科的研究中，如：细胞工程研究中的细胞融合，细胞的核移植以及基因工程研究中的基因移植等都需要利用培养的细胞进行。可以预料这些研究成果将有助于解决诸如像肿瘤的发生，遗传性疾病的