竞争性化学发光酶免疫分析法检测睾酮

1、竞争性化学发光酶免疫分析法检测睾酮    刘明泽黄岚李振雪徐伟张旗刘杰 中国图书分类号R392-33 摘要目的：建立高灵敏度的化学发光酶免疫分析法(CLEIA)检测睾酮。方法：包被抗体、标记抗原或包被抗原、标记抗体，用辣根过氧化物酶标记，鲁米诺增敏化学发光体系作为酶底物。结果：包被二抗、标记睾酮的方法灵敏度高、操作简便，灵敏度为0.063 ng/ml，睾酮浓度为1.0、5.0和10.0 ng/ml时，批内变异5.8%7.4%(n=20)，批间变异为6.6%8.7%(n=20)，回收率为98.2%104.0%。与5-二氢睾酮交叉反应为20.0%，与其它类固

2、醇无明显交叉反应。此法与宝灵曼(BM)直接酶免疫分析试剂盒比较有较好的相关性，CLEIA=0.915 BM+0.598 ng/ml，n=128，r=0.971，P0.001。结论：此法灵敏度高，有较好的准确性和重复性，与商品试剂盒有较好的相关性，适合临床应用。 关键词化学发光酶免疫分析法睾酮鲁米诺 Competitive chemiluminescent enzyme immunoassay for testosterone LIU Ming-Ze, HUANG Lan, LI Zhen-Xue et al. Pilotech Institute of Biomedical Engeneeri

3、ng, People's Hospital, BMU, Beijing 100034 AbstractObjective: To establish a chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) for testosterone. Methods: Antibody was coated and antigen was labeled or antigen was coated and antibody was labeled. Horseradish peroxidase was used as a label and enhanced

4、chemiluminescent system as substrate. Results: The method with coated second antibody and labeled testosterone had high sensitivity and simple measures. The sensitivity of the assay was 0.063 ng/ml. The testosterone was added to the steroid-free serum at concentrations of 1.0, 5.0 and 10.0 ng/ml, th

5、e within-run coefficients of variation were 5.8%7.4%(n=20), and run-to-runs' were 6.6%8.7%(n=2)respectively. The recovery rates were from 98.2% to 104.0%. The assay was not cross-reacted significantly with other steroids except 5-dihydrotestosterone with 20% cross reactivity. It correlated well

6、with Boehringer Mannheim enzyme immunoassay kit (BM) for testosterone. CLEIA=0.915 BM+0.598 ng/ml, n=128, r=0.971. Conclusion: The chemiluminescent enzyme immunoassay has high sensitivity, good accuracy, repeatability and correlation with commercial kit. The method is helpful to clinical laboratory

7、diagnosis. Key wordsChemiluminescent enzyme immunoassayTestosteroneLuminol 血清中睾酮的测定有着十分重要的意义，在男性可以用于研究性机能减退。在女性，血清睾酮的异常增高常提示肿瘤的可能性。另外，血清睾酮浓度的监测还有助于了解男性青春期发育的情况。近年来国内外建立了多种非放射免疫分析法检测睾酮1，但使用鲁米诺增敏化学发光体系的方法尚未见报道。本文研究了三种不同的方法，建立了直接的化学发光酶免疫分析法检测血清睾酮。 1材料与方法 1.1试剂睾酮、睾酮-C3-羧甲基肟、丹那唑、辣根过氧化物酶(HRP)、山羊抗鼠抗体(GAM)、

8、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠体(GAM-HRP)均购自Sigma公司。抗睾酮单克隆抗体购自美国Indyhill公司。ProClin 300购自美国Supelco公司。 1.2增敏化学发光液的配制参见文献2。 1.3去类固醇血清的制备将10 g活性碳加到100 ml正常人血清中，室温16 h间断震荡，悬液454 000×g离心2 h，用放射免疫分析法检测，不能测出睾酮。 1.4标准品的配制用无水乙醇将睾酮配制成一定浓度，然后加入去类固醇激素血清中，稀释成终浓度分别为0.0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 ng/ml，作为标准品。 1.5缓冲液的配制包被缓冲液：

9、0.05 mol/LpH 9.6 碳酸缓冲液。封闭液：在0.01 mol/L pH 7.4 PBS中加入1%脱脂奶粉。洗涤液：在0.01 mol/L pH 7.4 PBS中加入0.05%吐温-20。分析缓冲液：在0.01 mol/L pH 7.0 PBS中加入牛血清白蛋白10 mg/ml，丹那唑1 mg/L。各溶液中加入ProClin 300(12 000)防腐。 1.6睾酮的酶联标记3根据文献加以改进。睾酮-C3-羧甲基肟2.6 mg溶于450 l蒸馏的二氧六环中，后者含有50 l三正丁胺溶液(用二氧六环 3100 稀释)，然后加入50 l氯甲酸异丁酯溶液(用二氧六环3200稀释)，混合物1

10、0搅拌30 min，然后加入到HRP溶液中(2 mg/3.5 ml，10%二氧六环稀释，用NaOH将pH调到9.0，温度4)，搅拌5 min，pH调至8.5，4置4 h，透析48 h直到无游离的睾酮-C3-羧甲基肟，加ProClin 300(12 000)。 1.7睾酮-BSA的制备同1.6，用紫外分光光度计和放免法计算睾酮与牛血清白蛋白分子数之比为101。 1.8睾酮检测方法方法1：将睾酮抗体用包被缓冲液稀释，加到96孔板中，每孔100 l，4过夜，次日用封闭缓冲液每孔200 l，封闭30 min，洗涤3次，加入标准血清20 l，睾酮-HRP 100 l(110 000)，室温孵育60 mi

11、n后，洗涤3次，每孔加入200 l发光液，520 min检测，检测时间为1 s，检测仪器为EG&G Berthold 96P(德国)。方法2：将羊抗鼠抗体用包被缓冲液稀释成5 g/ml，加到乳白色96孔板中，每孔100 l，4过夜，次日用每孔200 l封闭液封闭30 min，洗涤3次，加入标准血清20 l、稀释的抗睾酮单克隆抗体50 l及睾酮-HRP 50 l(110 000)，孵育、洗涤、检测同方法1。方法3：将睾酮-BSA溶于包被缓冲液中，浓度为10 g/ml，加到乳白色96孔板中，每孔100 l，4过夜，次日用每孔200 l封闭液封闭30 min，加入20 l标准血清及100 l

12、用分析缓冲液稀释的抗睾酮单克隆抗体，室温孵育60 min，洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗鼠抗体，室温孵育30 min，洗涤3次，加发光液，检测同方法1。 2结果 2.13种方法的比较以BB0为90%作为检测灵敏度，方法1、方法2和方法3的检测灵敏度分别为0.196、0.063和0.078 ng/ml。 2.2重复性和准确性采用方法2，当空白血清中加入1.0、5.0、10.0 ng/ml睾酮检测，批内变异系数分别为7.4%、6.1%和5.8%(n=20)，批间变异系数分别为8.7%、6.6%和6.9%(n=20)，回收率为98.2%104.0%。     

13、; 2.3特异性此法与5-二氢睾酮交叉反应为20.0%，与雄烯二醇和雄烯二酮的交叉反应为0.7%。 2.4与其它方法的比较用宝灵曼直接酶免疫试剂盒检测同一批标本，与此法相比，二者所得数值有显著相关性，见图1，CLEIA=0.915 BM+0.598 ng/ml，n=128,r=0.971,P0.001。 图1化学发光酶免疫分析法与宝灵曼公司酶免疫分析试剂盒的比较 Fig.1Comparison of the chemiluminescent enzyme immunoassay with Boehringer Mannheim enzyme immunoassay kit 3讨论 在竞争法检测

14、抗原时，待检抗原和标记抗原竞争结合限量抗体，抗体的量越少，检测方法的灵敏度越高4-7。我们通过比较三种不同形式的竞争性免疫分析法，建立了灵敏度较高的化学发光酶免疫方法。方法2较方法1灵敏度高，这可能是由于在方法1中，结合到固相载体上的抗体量不易控制，包被浓度高，会降低灵敏度，包被浓度低，可能导致包被失败。而方法2中，加入反应体系中的抗睾酮抗体的量直接反映参与反应量，可通过减少其浓度提高灵敏度。方法3与方法2比较，灵敏度接近，但在方法3中，影响灵敏度的因素较多，包括包被抗原的量、抗原中半抗原与载体分子数之比以及抗体的浓度和纯度等，条件较方法2复杂，因此我们选用方法2。 此法具有很好的特异性，除了

15、与5-二氢睾酮有20.0%的交叉反应外，与其它类固醇交叉反应较小。由于5-二氢睾酮的含量仅为睾酮的十分之一，所以不会对睾酮的检测产生较大影响。 在睾酮的检测中，以辣根过氧化物酶作为标记酶，鲁米诺增敏化学发光体系作为底物，这种增敏化学发光免疫分析法与放免法比较有许多优点，除了避免使用放射性物质外，标记物较稳定，检测速度快。与普通酶免疫分析法相比，检测线性范围宽，更适用于定量测定。由于使用增敏化学发光液作为反应底物，可达到与放免相当的灵敏度。将固相载体选为可拆性96孔板，使操作简便，试剂用量减少，一次可以处理大量标本。 总之，此法有较高的灵敏度和特异性，有较好的准确性和重复性，与已建立的方法有很好

16、的相关性，适于临床应用。 作者简介：刘明泽，34岁，医学硕士，主治医师，主要从事临床免疫检验学研究 作者单位：北京医科大学人民医院引航医学生物技术研究所，北京100034 4参考文献 1Rassaie M J, Kumari L G, Pandey P K et al. A highly specific heterologous enzyme linked immunosorbent assay for measuring testosterone in plasma using antibodycoated immunoassay plates or polyproplyene tube.

17、 Steroids, 1992;57:288 2刘明泽，王子健，王虹et al. 化学发光免疫分析法测定血清甲状腺素.中国免疫学杂志，1996；12(3)：178 3Kominami G, Fujisaka I, Yamauchi A et al. A sensitive enzyme immunoassay for plasma cortisol. Clin Chim Acta, 1980;381:391 4Rajkowski K M, Hanquez C H, Bouzoumou A et al. A competitive microtitre plate enzyme immunoas

18、say for plasma testosterone using polyclonal anti-testosterone immunoglobulins. Clin Chim Acta, 1989;183:197 5Ali E, Sengupta J, Dhar T K. Sandwich immunoassay of small molecules (I): investigation with testosterone as model hapten. J Immunol Methods, 1992;147:173 6Masters A M, Hahnel R. Investigation of sex-hormone binding globulin