用酵母双杂交检测BAR与PDZ结构域的相互作用_图文

1、 山西大学学报(自然科学版CTG CTT AGG GTC CGC一3.PCR条件为:95,5min;94,30s;50,30s;72,1min.30个循环, 72延伸10min.产物经dPI和B口mH I双酶切后与载体pGADT7连接,转化E.如DH50【并在含Amp 的LB平板上筛选阳性克隆,经酶切鉴定和DNA测序予以确认.设计特异引物Primer3:5一CGG CAT ATG AGT TCA GGC ACA GC一3,Primer4:5一CGG GGA TCC CTA GAT GGG GAA GAC GTC一3,用同样方 法获得BAR的基因片段(相当于PICKl中128360氨基酸残基,与

2、载体pGBKT7连接后,转化E.fo矗 DH5a在含Kan的LB平板上筛选阳性克隆,并进行鉴定确认.制备酵母感受态细胞:酵母菌AHl09接种于YPD液体培养基中,30培养至OD。大于1.5时,将菌 液转至YPD液体培养基,接种时OD。约为o.2o.3,30培养3h,0D。约为o.4o.6时,用无菌水洗涤 酵母细胞后重悬于适量TE/LiAc中.共转化:将o.1pg待转化的重组质粒pGADPDZ/pGBKBAR等和o.1mg鱼精DNA分别加入1.5 mL的离心管中,加入o.2mL上述感受态酵母细胞,混匀,再加入o.6mL PEG/LiAc溶液,混匀.30培养 30min,42水浴热激15min,迅

3、速置于冰浴中.离心,用100弘L TE重悬,涂于SD(P“一,T矽一,H如一固体 培养基上,30倒置培养3d5d至阳性克隆出现.分别将上述SD平板上的酵母单菌落另接于有方格标识的SD平板,30培养过夜.将已灭菌的What man#5滤纸覆盖于无菌培养皿中,加入2mL的Z-buffer/Xgal溶液浸湿滤纸,另取一张覆盖于待测的酵 母SD平板上,轻压滤纸使每一个酵母克隆都粘附于滤纸上,用镊子揭起浸入液氮中,10s后取出,粘附有菌 体的面朝上与上述用Z_buffer/Xgal溶液浸湿的滤纸叠放并且也浸湿,小心去除滤纸间的气泡,30温育, 观察颜色变化,8h内出现蓝色判定为阳性.2结果2.1pGAD

4、PDZ重组子的构建及鉴定将重组质粒pGADPDZ用NdgI和B口优HI进行双酶切,酶切产物在Agarose胶上呈现270bp条带 (P423图1,经用pGADPDZ重组子为模板,如上述进行PCR,所得结果与用PICKl基因为模板的PCR扩 增产物得到的条带大小相同,重组质粒经DNA测序,被插入的基因序列与预期一致,表明构建的重组子正 确无误.2.2pGBKBAR重组子的构建及鉴定按上述方法构建重组质粒pGBKBAR,用dPI和B口mHI进行双酶切,在Agarose胶上获得696bp条 带,它与pGDBKBAR为模板进行PCR扩增产物相同(P423图2.重组质粒pGBKBAR经DNA测序,其 基

5、因序列与预期一致,表明构建的重组子正确无误.上述两种重组质粒经共转化入酵母细胞后,利用颜色反应观察它们之间的相互作用,结果见图3 (P423.从图中可以看出,由pGADPDZ/pGBKBAR共转化人酵母细胞的菌落在8h内显为蓝色(图3A, 为阳性,其结果与与阳性对照相同.而对照组pGADT7/pGBKT7(图3B、pGADPDZ/pGBKT7(图3C和 pGADT7/pGBKBAR(图3D共转化入酵母细胞的菌落在8h内没有变色,应为阴性.表明BAR结构域与 PDZ结构域相互之间发生了“猎物”与“诱饵”的结合作用,而单独BAR或PDZ结构域均没有反应.3讨论酵母双杂交系统是研究体内蛋白质之间相互

6、作用的重要手段之一,可以揭示功能上密切相关的两个蛋 白质问的构效关系m引.其基本原理是通过细胞内激活报道基因的表达探测蛋白一蛋白的相互作用.酵母 GAL4蛋白是半乳糖苷酶基因(gal的转录激活因子,由N端的DNA结合结构域(DNA-binding domain和 C端的转录激活结构域(transcriptionactivating domain组成,前者可识别DNA上的特异序列,并使转录激 活结构域定位于所调节的基因的上游,转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用,启动它所调节的基肖 虹等:用酵母双杂交检测BAR与PDZ结构域的相互作用 1,6:Markers,2:pGADT7/dPI, 3

7、:pGADPDZ/如I,4:pGADPDZ/出I+Bn优HI,5:以pGADPDZ为模板PCR扩增产物;裂后,仍具有各自的功能,而且处于不同部位的两结 能在体内检测出蛋白一蛋白间微弱的相互作用,具有非常高的敏感性.主要是因为:(1杂合蛋白是由高拷贝质粒和强启动子过量表达的蛋白.(2双杂交系统信号测定是在自然平衡浓度条件下进行,能检测出瞬间发生的信号反应,而体外检测如免疫共沉淀等物理方法需进行一系列洗涤过程,降低了信号强度,往往还会导致相互作用不再发生.(3杂交蛋白问稳定度可被激活结构域和结合结构域络合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合,这样使其各产生一些复合酶使信号放大.自St

8、audinger等o发现PICKl以来,PICKl与其配体的分子间相互作用已有不少报道,诸如AMPA受体的内饮与外吞哺9,酸性敏感性通道受体的结合m,多巴胺转运蛋白(DAT1妇等.然而,这种分子1,6:Markers,2:pGBKT7/deI,3:pGBKT7/dPI,4:pGBKBAR/dPI+B口优HI, 5:以pGBKBAR为模板PCR扩增产物; 图2pGBKBAR重组子的构建及鉴定图3用酵母双杂交法检测PDz与BAR结构域的相互作用间相互作用在神经细胞内的确切功能与作用机理仍然不十分清楚.关于PICKl分子内相互作用,着重于 PDZ结构域与BAR结构域问.研究表明,当PICKl PDZ

9、结构域同配体如GluR2结合或使PDZ缺失,将导 致PICKl分子聚集成“束”,而无配体存在时,PDz结构域可与BAR结构域相互作用,从而阻断PICKl重新 定位成“束”4,12.因此,深入探索PICKl分子内PDZ结构域与BAR结构域的相互作用,可望为进一步阐明 PICKl的结构与功能提供证据. 参考文献:1KIM cH,cHuNG HJ,LEE HK,甜以.Interaction of the AMPA Receptor subunit GluR2/3with PDz Domains Regulates Hippocampa Longterm Depression口.Prw口“Ac口d S

10、d U S A,2001,98(20:1172511730.2sTAuDINGER J,zH0u J,BURGEss R,以以.PIcKl:a Perinuclear Binding Protein and substrate for Protein Kinase cIsolated by the Yeast Twohybrid systemJ.,(比Bioz,1995,128(3:26371.3肖虹,袁静明,石亚伟.蛋白激酶ca相互作用蛋白的结构与功能J.细胞生物学杂志,2006,28(2:137140. 用酵母双杂交检测BAR与PDZ结构域的相互作用作者:肖虹 , 袁静明 , 石亚伟 ,

11、XIAO Hong, YUAN Jing-ming, SHI Ya-wei作者单位:山西大学,生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西,太原,030006刊名:山西大学学报(自然科学版 英文刊名: JOURNAL OF SHANXI UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION年,卷(期:2006,29(4参考文献(12条 1. GARDNER SM;TAKAMIYA K;XIA J Calcium-permeable AMPA Receptor Plasticity is Mediated bySubunitspecific Interactions

12、with PICK1 and NSF 2005(062. CHUNG HJ;STEINBERG JP;HUGANIR RL Requirement of AMPA Receptor GluR2 Phosphorylation for CerebellarLong-term Depression外文期刊 2003(56263. TOBY GG;GOLEMIS EA Using the Yeast Interaction Trap and Other two-hybrid-based Approaches to StudyProteinprotein Interactions外文期刊 2001(0

13、34. PEREZ JL;KHATRI L;CHANG C PICK1 Targets Activated Protein Kinase Calpha to AMPA Receptor Clustersin Spines of Hippocampal Beurons and Reduces Surface Levels of the AMPA-type Glutamate ReceptorSubunit 2 2001(155. HRUSKA-HAGEMAN AM;WEMMIE JA;PRICE MP Interaction of the Synaptic Protein PICK1(Prote

14、in Interactingwith C Kinase 1 with the Non-voltage Gated Sodium Channels BNC1 (Brain Na+ Channel 1 and ASIC(acidsensing ion Channel 20026. TORRES GE;YAO WD;MOHN AR Functional Interaction between Monoamine Plasma Membrane Transporters andthe Synaptic PDZ Domain-containing Protein PICK1外文期刊 2001(017.

15、TANOWITZ M;VON ZASTROW M Identification of Protein Interactions by yeast two-hybrid Screening andCoimmunoprecipitation 外文会议 20048. LU W;ZIFF EB PICK1 Interacts with ABP/GRIP to Regulate AMPA Receptor Trafficking 2005(039. PETER BJ;KENT HM;MILLS IG BAR Domains as Sensors of Membrane Curvature:the Amphiphysin BARStructure 外文期刊 2004(565710. 肖虹;袁静明;石亚伟 蛋白激酶Ca相互作用蛋白的结构与功能 期刊论文-细胞生物学杂志 2006(0211. STAUDINGER J;ZHOU J;BURGESS R PICK1:a Perinuclea