端粒酶与胃、结肠肿瘤的关系及其调控

1、端粒酶与胃、结肠肿瘤的关系及其调控     摘要:端粒是染色体末端的一种特殊结构，为DNA与蛋白质的复合体，端粒酶是目前发现的唯一能够延长端粒的一种RNA依赖性DNA聚合酶。在肿瘤细胞中端粒酶被激活，端粒酶活性检测将成为临床肿瘤检测的一种新方法。端粒酶调控是目前研究的热点之一，其活性抑制有望成为一种治疗肿瘤的新途径。    肿瘤是人类当前面临的最大顽疾，它的形成是一个多阶段的过程。原癌基因的激活、抑癌基因的突变等是肿瘤形成的重要分子基础。然而正常细胞在致癌因素作用下转变为恶性细胞并不意味着一定能形成肿瘤，因为哺乳动

2、物体内有一整套精细的调节机制控制着细胞的分裂次数，使细胞分裂达到一定程度后死亡。可见恶性肿瘤细胞获得无限增殖的特性即永生性在肿瘤的发生中起着至关重要的作用。端粒酶的激活恰是肿瘤获得永生性的主要途径。本文就端粒酶与胃、结肠肿瘤的关系及端粒酶的调控作一综述。    1端粒、端粒酶的结构和功能    端粒是染色体末端的一种特殊结构，是DNA与相关蛋白质的复合体1。端粒DNA由许多短的富含鸟嘌呤（G）的重复序列串联而成，可长达10kb以上。人的端粒重复序列为TTAGGG，长达15kb2。真核细胞染色体端粒DNA富含G链，较

3、富含胞嘧啶（C）链超出1216个核苷酸，形成3末端突出单链结构。端粒蛋白质往往与末端单链相结合维持DNA高级结构，使其末端不能被核酸酶所识别3。人类端粒蛋白的主要成分已被克隆4，其具体功能尚待进一步研究。    端粒主要有两大生理功能：（1）维持染色体结构的完整性，防止染色体被核酸酶降解及染色体间相互融和。（2）防止染色体结构基因在复制时丢失，解决了末端复制的难题。DNA复制时，DNA聚合酶必须在RNA引物基础上从5向3方向延伸，而5端RNA引物去除后因无引物的存在而不能复制，结果每复制一次染色体末端将丢失一段序列。端粒的存在使每次丢失的仅为端粒的一部分

4、，从而保护了染色体内部的结构基因5。另外，有些研究还显示，端粒与核运动有关，可能对同源染色体的配对重组有重要意义。    端粒的合成主要依靠端粒酶来催化。端粒酶是RNA与蛋白质组成的核糖核蛋白，是一种RNA依赖性DNA聚合酶6。人类端粒酶RNA成分已被成功克隆，它包括与端粒重复序列互补的11个核苷酸5-CUAACCCUAAC-37。四膜虫等几种生物的端粒酶蛋白组分已被克隆，它对维持端粒酶的功能是必须的。但到目前为止，人的端粒酶蛋白组分尚未见报道。    端粒酶的主要作用是维持端粒的长度。它能利用端粒3端单链为引物，

5、自身的RNA为模板合成端粒重复序列添加到染色体末端，从而延长端粒的长度8。人的生殖细胞、造血干细胞及T、B淋巴细胞中端粒酶有不同程度的表达，而在正常的体细胞中，端粒酶处于失活状态，因此体细胞随细胞分裂次数的增加端粒逐渐缩短。端粒的长度与有丝分裂次数相关，所以端粒又有细胞的“有丝分裂钟”之称9。    2端粒酶与胃、结肠肿瘤    恶性肿瘤细胞的一个重要的生物学特征是永生性，这是肿瘤发生机制中十分关键的环节，永生性的获得与端粒酶的激活有密切关系。有些学者提出了肿瘤发生的端粒假说：由于正常体细胞端粒酶失活，端粒随着有丝

6、分裂次数的增加而缩短，当端粒缩短到一定程度细胞停止分裂进入永生化期即M1期。此期大部分细胞在p53基因调控下衰老死亡，仅有少部分细胞通过某些病毒癌基因的整合或p53、Rb等抑癌基因的突变使细胞逃脱死亡。此时细胞可再继续分裂50次左右，端粒长度缩短到危机点，细胞进入永生化期即M2期。在此期，绝大部分细胞由于端粒极度缩短不能维持其功能而死亡。只有少部分细胞通过某些尚未阐明的机制激活端粒酶，使端粒长度得以维持，成为永生化细胞10。    到目前为止，很多实验都有力地支持肿瘤形成的端粒假说。1994年，Kim等6首次采用一种高灵敏度的TRAP方法检测永生化细胞、

7、肿瘤组织和正常组织端粒酶活性发现：代表人类18种不同组织的永生化细胞98%（98/100）端粒酶阳性；代表人类12种肿瘤的针吸活检组织90%（90/101）端粒酶阳性；而非永生化细胞（0/22）及癌旁正常组织（0/50）均未检测到端粒酶活性。这充分证实了端粒酶在肿瘤细胞中将再活化，自此，端粒酶与肿瘤关系的研究揭开了新的一页。    近几年来研究发现，端粒酶与胃、结肠肿瘤也有密切关系。为了解胃及结肠癌的发生、发展是否与端粒酶的活化有关，Tahara等11用TRAP法检测胃、结肠癌及其癌前病变的端粒酶活性。结果显示：多数胃、结肠癌及所有转移瘤均为端粒酶阳性；

8、早期粒膜癌、大多数胃肠道癌前病变也呈端粒酶阳性。因此认为端粒酶的活化可能发生在肿瘤的早期阶段，并与肿瘤的恶性进程有良好的相关性。端粒酶可作为胃肠道肿瘤诊断的有力生物标志。日本学者Hiyama等12检测了66例胃癌瘤体组织及癌旁正常组织，肿瘤组织85%（56/66）显示端粒酶活性，10例阴性标本中8例为早期胃癌。端粒酶阳性者往往属于进展期胃癌，且瘤体较阴性者大，病人生存期较阴性者短。66例患者的瘤体标本中有14例端粒长度发生了变化（延长或缩短），14例均为端粒酶阳性。FCM检测66例患者的瘤体标本，22例非整倍体均为端粒酶阳性。这些结果表明：端粒酶的激活是肿瘤发生多基因因素中的一种，特别是胃癌晚

9、期更是常见。遗传性非息肉性结直肠癌（HNPCC）较散发型结肠癌发病年龄小，细胞分裂次数少，可能有较长的端粒而未激活端粒酶，且HNPCC占结肠癌的比例与端粒酶阴性结肠癌的比例相似，HNPCC患者端粒酶是否未被激活呢？Zhi huali等人做了该方面的研究。他们发现，77% HNPCC为端粒酶阳性，散发结肠癌端粒酶阳性率为81%，两者无统计学差异，且端粒酶的激活与临床分期无明显关系。最后得出结论：端粒酶的激活在HNPCC与散发结肠癌中均为一种普遍现象13。    3端粒酶的调控    端粒酶活性的调控问题至今尚未完全阐

10、明，但至少与激素、细胞周期及分化、基因和端粒的结构等因素有关。    首先，激素对端粒酶活性有调节作用。用实验方法将雄性大鼠去势，退化的前列腺及精囊腺由于无激素的作用成为干细胞的储存池，去势的腺体在雄激素刺激下还可以再生。检查正常、去势后及再生的前列腺和精囊腺的端粒酶活性发现：正常腺体酶活性阴性，去势后腺体酶活性变为阳性，而雄激素刺激再生的腺体端粒酶失活。该实验证实了雄激素对前列腺和精囊腺的端粒酶活性有下调作用，并且为研究端粒酶活性调节提供了一种活体模型14。    端粒酶活性的调控与细胞分化和细胞周期也有密切关系

11、，细胞分化越完全，端粒酶稍大性越低。诱导永生化细胞分化将终止端粒酶活性，用分化剂诱导HL-60、K-562等细胞分化，端粒酶活性出现下调，由于分化剂不能直接抑制酶活性，且分化细胞的提取物也不能直接抑制酶活性，说明端粒酶活性下调是诱导细胞分化的结果15。而且永生化细胞分裂过程中其酶活性不是一成不变的，通过接触抑制、去除生长因子、诱导细胞衰老等方法可使永生细胞退出细胞周期，停止分裂，端粒酶活性下降。如静息细胞重新进入细胞周期则端粒酶再次激活16。在细胞周期的不同阶段端粒酶活性也不尽相同，肿瘤细胞进入G1/S期酶活性逐渐增加，在S期活性最高，而在G2/M期酶活性则逐渐消失17。细胞周期调节因子与端粒

12、酶活性间也有密切关系，乳腺癌端粒酶活性的研究表明：高水平cyclinD、高水平cyclinE及低水平P16INK4均使端粒酶活性下调18。    基因水平的调节同样在端粒酶活性调控中起重要作用，有人观察到肺癌细胞端粒长度缩短，同时伴有p53、Rb基因的缺失。研究表明，端粒酶RNA基因位于染色体3q26.3，肿瘤细胞中可扩增且转录增强19。应用细胞融合技术研究发现，将缺失3号染色体而端粒酶阳性的肾癌细胞（RCC）与带有3号染色体的微小细胞融合，则RCC细胞端粒酶活性下降，端粒缩短。而用同样方法在宫颈癌细胞株上却不能得到类似结果，说明端粒酶活性受多基因的调节

13、20。    端粒结构的改变影响着端粒酶的活性。端粒末端的单链结构能通过G?G配对形成四聚体，使端粒酶RNA模板无法与端粒相结合，从而不能催化端粒的合成。端粒结合蛋白的数目及其修饰也影响着端粒酶活性。目前认为，细胞内有某种机制可以识别TBF（端粒结合因子）的数目，当其超过一定阈值时将抑制端粒酶活性。随着端粒的缩短，TBF减少，对端粒酶的抑制减弱，端粒得以延长。现已证明的TBF因子有Hela细胞的端粒结合蛋白及酵母菌的Raplp和Tazlp21。还有实验证明，TLPI（端粒结合蛋白组分1）基因编码的蛋白产物为p240和p 230，p 240是p 230在体

14、内的修饰形式，p 230是 端粒酶阳性细胞的主要形式，由此提示TLP1蛋白的修饰可能在体内调节端粒酶的活性22。    4端粒酶与肿瘤治疗的新思路    肿瘤细胞端粒酶活性升高是一种普遍现象，能否通过抑制端粒酶活性从而治疗肿瘤呢？现在已经有学者开始着手进行该方面的研究。端粒酶活性的抑制可以通过许多途径产生：应用反义RNA技术抑制酶活性；通过某些逆转录酶抑制剂抑制酶活性；改变端粒酶蛋白结构使其失活；通过诱导端粒酶RNA突变使其丧失生物学功能。最近还有研究显示，将端粒酶阳性细胞与端粒酶阴性细胞相融合可使端粒酶失活。由于

15、端粒酶在正常体细胞中失活，所以端粒酶抑制疗法较放、化疗副作用小且针对性强。但是该疗法治疗肿瘤能否成功还有很多问题需要解决：（1）端粒酶的激活与肿瘤发生之间是因果关系还是相关关系尚需进一步实验来区分。（2）端粒酶在正常细胞无活性，但在生殖细胞、造血干细胞及T、B淋巴细胞中均有酶活性，该方法可能对生殖、造血及免疫系统有影响。（3）端粒长度的维持可能有其他旁路途径，如果这些旁路途径被激活，端粒酶抑制疗法将失败。尽管有问题存在，目前大多数学者仍认为端粒酶抑制疗法是一种极有前途的治疗肿瘤的新方法，对之寄予很大希望。    总之，端粒、端粒酶与肿瘤关系的发现为研究肿

16、瘤的发生、发展和治疗提供了一种崭新的思路，引起了医学科学家的极大兴趣。随着理论研究的深入，该方面的成果必将造福于人类。    参考文献    1 Creider CW et al. Cell,1987;51:887898    2 moyzis PK et al. Proc Natl Acad Sci USA,1988;85:66226626    3 blackburn EH et al, Nature,1991;350:569573

17、    4 chong L et al.Science,1995;270:16631667    5 olovnikou AM et al. J Theor Biol,1973;41:181190    6 kim NW et al. Science,1994;266:20112015    7 feng JL et al. Science,1995;269:12361241    8 greid

18、er CW et al. Nature,1989;337:331337    9 harley CB et al. Nature,1990;345:458460    10 wright WE et al. Exp Gerontol,1992;27:383389    11Tahara h et al. Clin Cancer Res,1995;1:12451251    12 hiyama E et al. Cancer Res,1995;55:32583262    13 li ZH et al. Am J Pathology,1996;148:10751079&nbs