脱氧核糖核酸电化学传感器的原理及其应用

1、脱氧核糖核酸电化学传感器的原理及其应用陆晓军鞠先3(南京大学化学系,配位化学国家重点实验室,南京210093摘要对电化学DNA 传感器的组成及其在DNA 损伤研究、环境污染监控、病原基因检测、基因疾病诊断和药物机理分析等方面的应用进行了总结,并对其发展趋势进行了评述。关键词电化学脱氧核糖核酸传感器,脱氧核糖核酸,评述2001212229收稿;2002206206接受本文系国家自然科学基金资助课题(N o.299750131引言随着人类基因工程的迅速发展,传统的生化方法已不能满足需要,许多新的分析方法和检测器件应运而生,DNA 传感器便是其中之一。DNA 传感器的基本原理是检测由DNA 探针所提

2、供的分子识别过程,并通过一个换能器将检测结果转化为可识别信号。DNA 传感器种类很多,按换能方法分类,主要有光纤荧光法1,2、假布儒斯特角反射法3、表面等离子共振法4、压电共振法5,6、石英晶体微天平法7,8、表面声波法9,10、化学发光法11,12、电位滴定法13,14、阻抗谱法15,16、电容法17和伏安法1822等。其中,基于电化学换能方法的DNA 传感器因其体积小、花费低和易微型化等特点而备受人们青睐。有关DNA传感器的评论文章近年来已有报道2326。1997年翟俊辉等23和朱滨等24曾对DNA 传感器作过总结,庞代文等25和彭图治等26也分别对电化学DNA 传感器的基本结构和性能作了

3、评述。本文着重对电化学DNA 传感器的原理和应用研究进展进行综述。2DNA 电化学传感器的原理电化学DNA 传感器一般由一个固定DNA 片段的电极和用于检测的电活性杂交指示剂构成25。在适当条件下,利用两条互补的DNA 单链间的特异性相互作用,使电极表面上已知序列的DNA 片段(DNA 探针与溶液中的待测序列DNA (靶序列发生杂交,通过杂交前后电活性指示剂的电化学响应的变化进行测定;或使电极表面的靶序列与溶液中的已标记电化学活性物质的DNA 探针杂交27来测定靶序列。在电极表面的DNA 双螺旋结构形成后,该传感器还可用于检测那些与DNA 双链有着特殊亲和力的电活性小分子。2.1基底电极有关核

4、酸的电化学研究早在40多年前就已见报道28,29,当时所使用的电极是滴汞电极。70年代,悬汞电极30,31和碳电极32的使用使DNA 的电化学研究得以深入。80年代末,Pale ek 等利用核酸修饰汞电极,将核酸伏安分析的灵敏度提高了几个数量级3337。核酸修饰汞电极主要利用DNA 在汞表面的吸附进行痕量RNA 、超螺旋DNA 及DNA 损伤的检测38。由于疏水性碱基与汞电极疏水性表面之间强烈的相互作用,导致电极表面的DNA 探针无法与靶序列杂交39,限制了汞电极在核酸分析中的应用。为了解决这个问题,人们将目光转向固体电极。常用于这一领域的电极为金电极和碳电极。Millan 等在1993年就已

5、利用玻碳电极获得了具有序列选择性的电化学DNA 传感器22;随后,Hashim oto 等发展了一种基于金电极的基因检测传感器18。其它碳材料如石墨电极40、碳糊电极41和石墨印刷电极42等也分别被用于DNA 传感器的研制。近年来,将Pt 电极用作电化学DNA 传感器的研究也见报道43,Napier 等则利用尼龙和硝化纤维聚合物修饰的锡掺杂的铟氧化物电极来测定DNA 上鸟嘌呤的电催化氧化44。第31卷2003年1月分析化学(FE NXI H UAX UE 评述与进展Chinese Journal of Analytical Chemistry 第1期1101152.2DNA 探针及其固定目前所

6、使用的DNA 探针大多为人工合成的短链DNA ,其长度从十几个碱基到上千个碱基不等,一般是使用已被公认的可识别出靶序列所需的最短序列。天然DNA 用作探针的应用则较少,庞代文等曾对天然小牛胸腺DNA 在玻碳电极、铂电极和金电极上的固定及修饰电极的性质进行了系统的研究4549。DNA 探针在电极上的固定是电化学DNA 传感器制备中的关键步骤,Palanti 等曾对固定化方法进行过总结50,如吸附法、生物素2亲和素法及共价键合法等。在这些修饰方法中吸附法是最简单的,一般是直接将DNA 溶液滴涂在裸电极上46,或者将电极浸入DNA 溶液中在一定电压下富集5152。但是,吸附法固定的DNA 在杂交过程

7、中可能脱附,且该方法易扭曲DNA 的结构,造成固定DNA 的无法接近和不正确杂交,因而吸附法并没有成为DNA 杂交传感器制备的主要方法。Fang 等曾利用生物素2亲和素之间特殊的相互作用将生物素标记单链DNA 分子固定到修饰有亲和素的固体表面53;K rull 等将单链DNA 的端基衍生上C 16烷基,然后通过LB 膜技术固定DNA 探针5456;而G arnier 等则利用吡咯的电聚合进行DNA 探针的固定57。目前,共价键合法已普遍用于DNA 杂交传感器的研制。根据不同的电极表面,可采用不同的键合方法。对于玻碳电极,一般可先将电极表面氧化生成羧基,再在水溶性碳二亚胺(E DC 、N 2烷基

8、磺基琥珀酰亚胺(NHS 等偶联活化剂的帮助下将单链DNA 固定于电极表面22。碳电极的表面氧化则有多种方法,如高锰酸钾湿法氧化、氧等离子体处理或电化学氧化处理等。对于碳糊电极,可在碳粉中预先掺入一些添加物,如十八烷基胺或十八烷基酸21等,再通过添加物上的官能团键合DNA 。DNA 在金电极上的固定主要是利用Au 2S 键,一种方法是将DNA 链端巯基化18,58,59,另一种方法是在金电极表面形成具有特殊官能团的巯基自组装单层,再共价键合DNA 分子45,48,60。庞代文等曾将巯基乙醇、半胱胺和巯基丙酸3种具有不同官能团的硫化物自组装单层用于DNA 的固定,指出巯基乙醇修饰单层是3者中效果最

9、好的DNA 固定基底48。2.3电活性指示剂根据与固定DNA 之间的关系,电活性杂交指示剂可分为内部和外部指示剂两类。所谓内部电活性指示剂是利用DNA 分子中碱基或其它修饰基团的电活性进行检测。众所周知,虽然DNA 链的脱氧核糖和磷酸骨架均是电化学非活性,但是鸟嘌呤和腺嘌呤的氧化电位却在碳电极的电化学窗口之内61。Wang 等用肌苷代替DNA 探针中的鸟嘌呤来消除探针中鸟嘌呤的氧化峰,然后利用探针与靶序列杂交后出现的鸟嘌呤的氧化峰进行检测62。方禹之等在靶序列DNA 的末端衍生二茂铁基团,通过检测二茂铁电化学信号的有无来表征杂交事件的发生与否63。Lumley 2W oodear 等则在待测D

10、NA 链端衍生辣根过氧化酶,一旦进行杂交反应,修饰电极便能催化过氧化氢的电化学还原64。另一种内部指示剂法是三明治法,它先将待测的长链DNA 与固定化的短链探针杂交,然后再让长链上未杂交部分与修饰有电活性标记物的短链DNA 杂交,从而进行电化学检测65。内部指示剂在灵敏度和选择性上有一定的优势,但其探针的合成步骤较繁琐,因而目前在电化学DNA 传感器领域占主导地位的仍然是外部指示剂法。外部指示剂是指那些能与DNA 单、双链以不同作用方式结合的电活性小分子,大致可分为两类:一类是过渡金属的络合物,主要有Pt 、Ru 、C o 、Fe 和Os 等金属的络合物6671;另一类为杂环有机化合物,如乙锭

11、、蒽类、吩噻嗪、吖啶及苯甲基紫罗碱等7276。Pyle 等曾对指示剂与DNA 结合的不同影响因素进行过研究,如几何形状、分子大小、疏水性和形成氢键的能力等,他们认为分子几何形状的影响最为重要68。Hashim oto 等在比较众多电活性指示剂在热解石墨电极上的伏安性质之后,指出道诺霉素有合适的氧化还原电位,较高的电流密度且对单、双链DNA 有不同的响应电位,所以是一种最理想的DNA 杂交指示剂19。Aslanoglu 等重点研究了金属络合物的离子电荷、几何形状和配体对键合常数与键合位点数的影响,同时指出微电极在研究金属络合物与DNA 相互作用方面有着常规电极无可比拟的优势77。3电化学DNA

12、传感器的应用核酸是已被广泛应用的分子识别工具78,基于核酸识别的电化学DNA 传感器的应用已涉及环境、医药、食品等诸多领域。大致包括DNA 损伤研究、环境污染监控、病原基因检测、基因疾病诊断、药物机111第1期陆晓军等:脱氧核糖核酸电化学传感器的原理及其应用理分析等几个方面。3.1DNA损伤研究DNA损伤是指由于化学物质的作用或受辐射而引起的DNA磷酸核糖骨架的断裂,磷酸、核糖或碱基的损伤等。DNA损伤种类繁多,仅氧化损伤一类,目前已证实的就有100多种79。由于DNA损伤会极大地扰乱生物体正常的生理活动,所以,很久以来就是生化研究的一个重点。Palecek等曾在1996年80和1998年81

13、两次对用于DNA损伤研究的DNA传感器进行了综述,并认为基于汞电极的传感器最适合于DNA损伤的研究。2000年,他们又用悬汞电极发展了一种新的DNA传感器用于监控由Fenton 反应所造成的DNA链的断裂82。3.2环境污染监控众所周知,许多环境污染物的毒性就表现在它们与DNA间的相互作用,因此,DNA传感器可被用于环境中污染物的监控。Wang等在1997年曾对这一方面的发展进行了综述83,提出了3种检测方案:利用固定的双链DNA修饰层使电活性污染物在电极上优先富集;检测由污染物键合引起的电极表面修饰核酸内在氧化信号的改变;对于非电活性的分析物,可通过它与一电活性物质在DNA修饰电极表面的结合

14、竞争来进行测定。其后,K rull等又利用基于双层类脂膜(BLMs的电化学DNA传感器来检测环境中黄曲霉素M154和肼类物质55,其中黄曲霉素M1的检测限达到0.5mm olL,而肼类物质的检测限更达到gL级。3.3病原基因检测人类的许多传染性疾病是由环境中的病毒、病菌或寄生虫引起的,所以,病原基因的测定也是电化学DNA传感器的一个重要研究领域。例如,在发展中国家每天约有11000名儿童死于由隐孢子虫引起的腹泻,Wang等利用一段38个碱基的低聚核苷酸探针制备了一种隐孢子虫DNA传感器,通过计时电位溶出法检测,检测限可达到ng级84。同样的方法也可被用于检测大肠杆菌85、爱滋病毒86和结核杆菌

15、87等。Ozs oz等研制出一种乙肝病毒DNA传感器,用示差脉冲伏安法验证了该传感器对特定序列DNA片断的选择性88。Azek等制备了巨细胞病毒的基因传感器,其检测结果比凝胶电泳灵敏23000倍,比比色杂交试验灵敏83倍89。Ivnitski等对用于食品工业中病原细菌检测的电化学传感器的原理和应用作了总结,并对该方面未来的发展进行了展望90。3.4基因疾病诊断现代医学的研究成果表明,许多疾病,如癌症和遗传病等的发生都与基因的突变有关。Hashim oto 等将一段20个碱基的探针固定于金电极,制备了一种用于致癌基因v2myc序列检测的电化学传感器,实验结果证明其效果很好18。Wang等通过一段

16、固定在传感器上的17个碱基的肽核酸PNA探针完成了抑癌基因P55的点突变检测91。Bardea等在金电极上组装了一个3组分的低聚核苷酸修饰层,通过法拉第阻抗谱法发展了一种家族蒙性白痴症的特效生化传感器16。3.5药物机理分析许多药物是通过与DNA的结合而起作用的,因而电化学DNA传感器是这些药物与DNA作用机理研究的有力工具。Maeda等用DNA修饰电极研究了抗疟药阿的平与DNA分子之间的强烈作用92。Brett等利用DNA传感器研究了硝基咪唑类药物的电化学还原,与普通玻碳电极相比,DNA传感器能预富集药物,因而可达到更低的检测限93。该课题组还用DNA传感器进行了血清样品中抗癌药物Carbo

17、platin的电化学测定,检测限为5.710-6m olL94。Brabec等将修饰了质粒体DNA的石墨电极作为抗癌药物铂类化合物的传感器,用于该类药物检测的速度快、检测限低95。4结语作为一种新型生物传感器,电化学DNA传感器不仅具有DNA杂交反应高度的特异性和可逆性,又具有电化学传感器易于微型化等传统特点,已成为当今生物传感器研究的热门,是DNA分析的重要工具。但是,迄今为止,这一领域的工作基本停留在实验室阶段,真正商品化的产品还不多。困扰其发展的主要问题在于相对低的灵敏度和稳定性。为了解决灵敏度问题,人们开始引入一些DNA扩增方法。211分析化学第31卷如Marrazza 等将电化学DN

18、A 传感器和聚合酶链反应(PCR 结合在一起,实现了载脂蛋白E (apoE 的不同基因型的快速区分96。可以预计,随着研究的不断深入,高灵敏度的电化学DNA 传感器将得到快速发展,以适应生命科学研究和临床诊断领域的需要。R eferences1G raham C R ,Leslie D ,Squirrel D J.Biosens .Bioelectron .,1992,7(7:4874932Piunno P E A ,K rull U J ,Huds on R H E ,Damha M J ,C ohen H.Anal .Chim .Acta ,1994,288:2052143Mandeniu

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